Anvendelse af AlDeSense til stratificering af kræftceller i æggestokkene baseret på aldehyddehydrogenase 1A1-aktivitet
Summary
Metoder til måling af ALDH1A1-aktivitet i levende celler er kritiske i kræftforskning på grund af dets status som en biomarkør for stamme. I denne undersøgelse anvendte vi en isoform-selektiv fluorogen sonde til at bestemme de relative niveauer af ALDH1A1-aktivitet i et panel af fem ovariecancercellelinjer.
Abstract
Tilbagefald efter kræftbehandling tilskrives ofte persistensen af en underpopulation af tumorceller kendt som kræftstamceller (CSC’er), som er kendetegnet ved deres bemærkelsesværdige tumorinitierende og selvfornyelseskapacitet. Afhængigt af tumorens oprindelse (f.eks. æggestokke) kan CSC-overfladebiomarkørprofilen variere dramatisk, hvilket gør identifikationen af sådanne celler via immunhistokemisk farvning til en udfordrende indsats. Tværtimod har aldehyddehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) vist sig at være en fremragende markør til identifikation af CSC’er på grund af dens bevarede ekspressionsprofil i næsten alle stamceller, herunder CSC’er. ALDH1A1-isoformen tilhører en superfamilie af 19 enzymer, der er ansvarlige for oxidationen af forskellige endogene og xenobiotiske aldehyder til de tilsvarende carboxylsyreprodukter. Chan et al. udviklede for nylig AlDeSense, en isoform-selektiv “turn-on” sonde til påvisning af ALDH1A1-aktivitet samt et ikke-reaktivt matchende kontrolreagens (Ctrl-AlDeSense) for at tage højde for farvning uden for målet. Dette isoform-selektive værktøj har allerede vist sig at være et alsidigt kemisk værktøj gennem påvisning af ALDH1A1-aktivitet i K562 myeløve celler, mammosfærer og melanomafledte CSC-xenotransplantater. I denne artikel blev sondens anvendelighed fremvist gennem yderligere fluorimetri, konfokal mikroskopi og flowcytometrieksperimenter, hvor den relative ALDH1A1-aktivitet blev bestemt i et panel af fem ovariecancercellelinjer.
Introduction
Kræftstamceller (CSC’er) er en underpopulation af tumorceller, der udviser stamcellelignende egenskaber1. I lighed med deres ikke-kræftformede modstykker besidder CSC’er den ekstraordinære evne til selvfornyelse og formering. Sammen med andre indbyggede mekanismer, såsom opregulering af ATP-bindende kassettetransportører, spares CSC’er ofte fra indledende kirurgisk debulking-indsats samt efterfølgende adjuverende terapi2. På grund af deres kritiske rolle i behandlingsresistens3, tilbagefald4 og metastase5 er CSC’er blevet en prioritet inden for kræftforskning. Selvom der er en række celleoverfladeantigener (f.eks. CD133), der kan bruges til at identificere CSC’er6, har udnyttelse af den enzymatiske aktivitet af aldehyddehydrogenaser (ALDH’er), der findes i cytoplasmaet, vist sig som et attraktivt alternativ7. ALDH’er er en superfamilie af 19 enzymer, der er ansvarlige for at katalysere oxidationen af reaktive endogene og xenobiotiske aldehyder til de tilsvarende carboxylsyreprodukter8.
Generelt er aldehydafgiftning afgørende for at beskytte celler mod uønskede tværbindingshændelser og oxidativ stress, der kan skade stamcellernes integritet9. Desuden styrer 1A1-isoformen retinsyremetabolismen, hvilket igen påvirker stammenhed via retinaldehydsignalering10. AlDeSense 11,12, en lille molekyle aktivitetsbaseret sensing (ABS) sonde til selektivt at detektere ALDH1A1 aktivitet, blev for nylig udviklet. ABS-design opnår analysanddetektion gennem en kemisk ændring snarere end en bindingshændelse, hvilket giver mulighed for høj selektivitet og reduceret respons uden for målet13,14,15,16. Designprincippet for den isoform-selektive fluorogene sonde er afhængig af en donorfotoinduceret elektronoverførselsmekanisme (d-PeT)17, der stammer fra aldehydfunktionsgruppen, som tjener til at undertrykke sondens fluorescerende signatur18. Ved ALDH1A1-medieret omdannelse til carboxylsyren låses strålingsafslapning op for at give et stærkt fluorescerende produkt. Fordi d-PeT-slukning aldrig er 100% effektiv, blev den resterende fluorescens, der kan føre til mulige falske positive resultater, overvejet ved etablering af dette assay gennem udviklingen af Ctrl-AlDeSense, et ikke-responsivt reagens med matchende fotofysiske egenskaber (f.eks. Kvanteudbytte) og et identisk cytoplasmatisk farvningsmønster i celler. Når det bruges i tandem, kan denne unikke parring pålideligt skelne celler med høj ALDH1A1-aktivitet fra dem, der udviser lave niveauer via fluorimetri, molekylær billeddannelse og flowcytometri. Flere vigtige fordele er forbundet med brugen af isoform-selektive aktiverbare farvestoffer i forhold til traditionelle immunhistokemiske metoder. For eksempel antages CSC’er at være begravet dybt inde i en tumor og er dermed mere tilgængelige for et lille molekyle i forhold til store antistoffer19. Derudover ændrer det omvendte fluorescerende produkt ikke kovalent nogen cellulær komponent, hvilket betyder, at det let kan fjernes via vaskecyklusser for at efterlade en CSC i en umodificeret tilstand. Endelig identificerer turn-on-responsen kun levedygtige celler og funktioner, ligesom MTT-assayet, på grund af dets afhængighed af NAD + -cofaktoren.
Figur 1: Skematisk demonstration af fluorescerende tænding af AlDeSense. Det isoform-selektive farvestof aktiveres af ALDH1A1 og kan bruges til at identificere forhøjet ALDH1A1-aktivitet i ovariecancerceller via fluorimetri, molekylær billeddannelse og flowcytometri. Klik her for at se en større version af denne figur.
I tidligere arbejde stratificerede isoform-selektiv fluorogensondeanalyse med succes ALDH-høje (ALDH +) celler fra ALDH-celler med lav (ALDH-) i K562 humane kroniske leukæmiceller, MDA-MB-231 humane brystkræftceller og B16F0 murine melanomceller. Dette er vigtigt, fordi høj ALDH1A1-proteinekspression for mange kræfttyper betyder en dårligere klinisk prognose20. Dette forudsætter, at forhøjede niveauer af ALDH1A1 er tegn på CSC’er, som kan undgå behandling, udvikle resistens og sprede sig i hele kroppen. I tilfælde af kræft i æggestokkene er der imidlertid undersøgelser, der rapporterer det modsatte fund (høj ALDH1A1-ekspression er forbundet med forbedret patientoverlevelse)21,22,23,24. Selvom dette kan virke modstridende ved første øjekast, korrelerer ekspression ikke nødvendigvis med enzymaktivitet, som kan påvirkes af ændringer i tumormikromiljøet (f.eks. pH-flux, iltgradienter), tilgængeligheden af NAD+-cofaktor- eller aldehydsubstraterne, niveauer af carboxylsyrer (produkthæmning) og posttranslationelle modifikationer, der kan ændre enzymaktiviteten25 . Derudover er kræft i æggestokkene opdelt i fem histologiske hovedtyper (serøs af høj kvalitet, lavkvalitets serøs, endometrioid, klar celle og mucinøs), som vi antager vil have variable niveauer af ALDH1A1-aktivitet26. Med det formål at undersøge ALDH1A1-aktivitet i ovarietumorer blev der anvendt et isoform-selektivt fluorogent sondeassay til at identificere ALDH1A1+ populationer i et panel af fem ovariecancercellelinjer, der tilhører de forskellige histologiske typer, der er nævnt ovenfor. De cellelinjer, der blev testet i denne undersøgelse, inkluderer BG-1-, Caov-3-, IGROV-1-, OVCAR-3- og PEO4-celler, der dækker klare celle- og serøse histotyper. Heri blev sondens alsidighed og generaliserbarhed fremhævet for at identificere CSC’er for forskerne, der søger at udføre lignende undersøgelser i andre udødeliggjorte kræftcellelinjer samt patientprøver. Brugen af AlDeSense vil kaste lys over de biokemiske veje, der er involveret i CSC-vedligeholdelse i komplekse vævsmikromiljøer og potentielt tjene som et klinisk værktøj til bestemmelse af prognose og måling af kræftaggressivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pan-selektivitet er en væsentlig begrænsning for mange ALDH-sonder; Imidlertid er der for nylig rapporteret flere isoform-selektive eksempler 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. Den isoform-…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R35GM133581 til JC) og Cancer Center at Illinois Graduate Scholarship (tildelt SG). JC takker Camille og Henry Dreyfus Foundation for støtte. Forfatterne takker Dr. Thomas E. Bearrood for hans indledende bidrag til at forberede lagre af AlDeSense og AlDeSense AM. Vi takker Oliver D. Pichardo Peguero og Joseph A. Forzano for deres hjælp med at forberede forskellige syntetiske prækursorer. Vi takker professor Erik Nelson (Institut for Molekylær og Integrativ Fysiologi, UIUC) for Caov-3, IGROV-1 og PEO4 celler. Vi takker professor Paul Hergenrother (Institut for Kemi, UIUC) for BG-1-celler. Vi takker kernefaciliteterne på Carl R. Woese Institute for Genomic Biology for adgang til Zeiss LSM 700 Confocal Microscope og tilhørende software. Vi takker flowcytometrifaciliteten for adgang til BD LSR II CMtO-analysator. Vi takker Dr. Sandra McMasters og Cell Media Facility for hjælp til at forberede cellekulturmedier.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25-050-CI | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| BG-1 | A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Flask | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biosafety Cabinet 1300 series A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | Provided by UIUC CMtO | ||
| FL microscope | EVOS | ||
| Fluorometer | Photon Technology International | ||
| Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Incubated Shaker | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin | Prepared by UIUC cell media facility |
Riferimenti
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC transporters in cancer stem cells: Beyond chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
- Islam, F., Gopalan, V., Smith, R. A., Lam, A. K. Y. Translational potential of cancer stem cells: A review of the detection of cancer stem cells and their roles in cancer recurrence and cancer treatment. Experimental Cell Research. 335 (1), 135-147 (2015).
- Li, F., Tiede, B., Massagué, J., Kang, Y. Beyond tumorigenesis: Cancer stem cells in metastasis. Cell Research. 17 (1), 3-14 (2007).
- Kim, W. T., Ryu, C. J. Cancer stem cell surface markers on normal stem cells. BMB Reports. 50 (6), 285-298 (2017).
- Pors, K., Moreb, J. S. Aldehyde dehydrogenases in cancer: An opportunity for biomarker and drug development. Drug Discovery Today. 19 (12), 1953-1963 (2014).
- Jackson, B., et al. Update on the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH) superfamily. Human Genomics. 5 (4), 283-303 (2011).
- Vasiliou, V., Pappa, A., Petersen, D. R. Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism. Chemico-Biological Interactions. 129 (1-2), 1-19 (2000).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Anorma, C., et al. Surveillance of cancer stem cell plasticity using an isoform-selective fluorescent probe for aldehyde dehydrogenase 1A1. ACS Central Science. 4 (8), 1045-1055 (2018).
- Bearrood, T. E., Aguirre-Figueroa, G., Chan, J. Rational design of a red fluorescent sensor for ALDH1A1 displaying enhanced cellular uptake and reactivity. Bioconjugate Chemistry. 31 (2), 224-228 (2020).
- Chan, J., Dodani, S. C., Chang, C. J. Reaction-based small-molecule fluorescent probes for chemoselective bioimaging. Nature Chemistry. 4 (12), 973-984 (2012).
- East, A. K., Lucero, M. Y., Chan, J. New directions of activity-based sensing for in vivo NIR imaging. Chemical Science. 12 (10), 3393-3405 (2021).
- Yadav, A. K., et al. Activity-based NIR bioluminescence probe enables discovery of diet-induced modulation of the tumor microenvironment via nitric oxide. ACS Central Science. 8 (4), 461-472 (2022).
- Yadav, A. K., et al. An activity-based sensing approach for the detection of cyclooxygenase-2 in Live Cells. Angewandte Chemie. 59 (8), 3307-3314 (2020).
- Ueno, T., et al. Rational principles for modulating fluorescence properties of fluorescein. Journal of the American Chemical Society. 126 (43), 14079-14085 (2004).
- Tanaka, F., Mase, N., Barbas 3rd, C. F. Design and use of fluorogenic aldehydes for monitoring the progress of aldehyde transformations. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3692-3693 (2004).
- Thurber, G. M., Schmidt, M. M., Wittrup, K. D. Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (12), 1421-1434 (2008).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. K. Aldehyde dehydrogenase its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Meng, E., et al. ALDH1A1 maintains ovarian cancer stem cell-like properties by altered regulation of cell cycle checkpoint and DNA repair network signaling. PLoS One. 9 (9), e107142 (2014).
- Kaipio, K., et al. ALDH1A1-related stemness in high-grade serous ovarian cancer is a negative prognostic indicator but potentially targetable by EGFR/mTOR-PI3K/aurora kinase inhibitors. The Journal of Pathology. 250 (2), 159-169 (2020).
- Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), in human epithelial cancers. PLoS One. 5 (4), e10277 (2010).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Modern Pathology. 22 (6), 817-823 (2009).
- Gardner, S. H., Reinhardt, C. J., Chan, J. Advances in activity-based sensing probes for isoform-selective imaging of enzymatic activity. Angewandte Chemie. 60 (10), 5000-5009 (2021).
- Reid, B. M., Permuth, J. B., Sellers, T. A. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biology and Medicine. 14 (1), 9-32 (2017).
- Tulake, W., et al. Upregulation of stem cell markers ALDH1A1 and OCT4 as potential biomarkers for the early detection of cervical carcinoma. Oncology Letters. 16 (5), 5525-5534 (2018).
- Nwani, N. G., et al. A novel ALDH1A1 inhibitor targets cells with stem cell characteristics in ovarian cancer. Cancers. 11 (4), 502 (2019).
- Roy, M., Connor, J., Al-Niaimi, A., Rose, S. L., Mahajan, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) expression by immunohistochemistry is associated with chemo-refractoriness in patients with high-grade ovarian serous carcinoma. Human Pathology. 73, 1-6 (2018).
- Landen Jr, C. N., et al. Targeting aldehyde dehydrogenase cancer stem cells in ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3186-3199 (2010).
- Condello, S., et al. β-catenin-regulated ALDH1A1 is a target in ovarian cancer spheroids. Oncogene. 34 (18), 2297-2308 (2015).
- Storms, R. W., et al. Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9118-9123 (1999).
- Duellman, S. J., et al. A bioluminescence assay for aldehyde dehydrogenase activity. Analytical Biochemistry. 434 (2), 226-232 (2013).
- Minn, I., et al. A red-shifted fluorescent substrate for aldehyde dehydrogenase. Nature Communications. 5, 3662 (2014).
- Dollé, L., Boulter, L., Leclercq, I. A., van Grunsven, L. A. Next generation of ALDH substrates and their potential to study maturational lineage biology in stem and progenitor cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (7), 573-578 (2015).
- Yagishita, A., et al. Development of highly selective fluorescent probe enabling flow-cytometric isolation of ALDH3A1-positive viable cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (2), 302-306 (2017).
- Maity, S., et al. Thiophene bridged aldehydes (TBAs) image ALDH activity in cells: Via modulation of intramolecular charge transfer. Chemical Science. 8 (10), 7143-7151 (2017).
- Koenders, S. T. A., et al. Development of a retinal-based probe for the profiling of retinaldehyde dehydrogenases in cancer cells. ACS Central Science. 5 (12), 1965-1974 (2019).
- Oe, M., et al. Deep-red/near-infrared turn-on fluorescence probes for aldehyde dehydrogenase 1A1 in cancer stem cells. ACS Sensors. 6 (9), 3320-3329 (2021).
- Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells. Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).
- Okamoto, A., et al. Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1. Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).
