蛍光 In situ ハイブリダイゼーションを用いた卵巣細胞のX染色体異常の探索
Summary
この記事では、X染色体異常のある女性の非移植および移植卵巣皮質組織における卵巣細胞のX染色体含有量を決定するための蛍光 in situ ハイブリダイゼーションに基づく2つの方法を紹介します。
Abstract
世界中の何百万人もの人々が出生力に関する問題に取り組んでいます。生殖能力の低下、あるいは不妊症でさえ、染色体異常が最も一般的である遺伝性疾患を含む多くの異なる原因が原因である可能性があります。蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)は、ヒトの染色体異常を検出するためによく知られ、頻繁に使用される方法です。FISHは主に、数値的または構造的な染色体異常を有する雄の精子の染色体異常の解析に使用されます。さらに、この技術は、卵巣発育異常を引き起こすことが知られているX染色体異常を検出するために女性にも頻繁に適用されます。しかし、リンパ球および/または頬細胞にX染色体異常を有する雌の卵巣細胞のX染色体含量に関する情報はまだ不足しています。
本研究の目的は、卵巣細胞のX染色体含量を特定するためのFISHに基づく2つの方法を提示することにより、女性のX染色体異常に関する基礎研究を進めることです。まず、X染色体異常を有する雌から移植されていない卵巣皮質組織中の単離卵巣細胞(卵母細胞、顆粒膜細胞、間質細胞)のX染色体含量を測定する方法について説明する。第2の方法は、免疫不全マウスへの長期移植後のX染色体異常を有する雌から、卵巣組織において新たに形成された二次卵胞および胞状卵胞の卵巣細胞のX染色体含有量を決定することによって、卵胞形成に対する染色体異常の影響を評価することに向けられている。どちらの方法も、X染色体異常のある女性の生殖能力についての洞察を得るための将来の研究に役立つ可能性があります。
Introduction
不妊症は男性または女性の生殖器系の健康問題であり、世界中で約1億8600万人の生殖年齢の個人が罹患しています1。不妊症のカップルの少なくとも35%で、不妊症は女性の生殖器系の障害によって引き起こされます2。遺伝的要因、生殖管異常、内分泌機能障害、炎症性疾患、医原性治療など、女性の不妊症を引き起こす可能性のある多くの要因があります3。
遺伝的異常は、不妊症の女性の約10%に存在します4,5。すべての遺伝的異常の中で、X染色体異常は卵巣発育不全の最も一般的な原因です2。いくつかの研究では、ターナー症候群(TS)またはトリプルX症候群の女性のX染色体異常は、生殖細胞の喪失の加速または卵形成障害による早期卵巣不全に関連していることが報告されています6,7,8。
X染色体の異常は、1)X染色体の数が異なっているがX染色体が損なわれていない数値異常に分けることができます。2)X染色体が遺伝物質を獲得または失った構造異常3,9。X染色体の数値異常は、構造異常よりも一般的であり、細胞分裂中の自発的なエラーによって引き起こされることがよくあります3,9。減数分裂中にこのようなエラーが発生すると、異数性配偶子につながり、最終的にはすべての細胞に染色体異常を伴う子孫につながる可能性があります。個体発生の初期段階の有糸分裂中に発生するエラーの結果として染色体細胞に染色体欠損が生じると、モザイク現象につながる可能性があります。これらの個体では、X染色体含有量が正常な細胞とX染色体異常を有する細胞の両方が存在する。
1980年代には、中期および間期の染色体上の特定の核酸配列を視覚化して位置を特定するために、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)と呼ばれる細胞遺伝学的手法が開発されました10,11。この手法では、蛍光標識されたDNAプローブを使用して染色体内の特定の配列に結合し、蛍光顕微鏡を使用して視覚化できます。
現在、FISHは臨床診断ツールとして広く使用されており、染色体異常を検出する際のゴールドスタンダードと見なされています10。生殖医療の分野では、精子に関するFISH分析を使用して、体細胞に数値的または構造的な染色体異常がある男性の精子のX染色体含有量に関する洞察を得ています12,13,14。これらの研究は、染色体異常のある男性は、正常な核型の男性と比較して、精液中に存在する異数性精子の頻度が高い可能性が高いことを示しました12,13,14。
精子とは対照的に、染色体異常を有する個体における卵巣細胞(卵母細胞、顆粒膜/テカ細胞、および間質細胞を含む)のX染色体含有量、およびこれらの細胞の異数性が生殖能力に及ぼす可能性のある結果についてはほとんど知られていない。精子と比較して卵巣細胞の核型に関する情報が不足している重要な理由は、女性が卵母細胞または卵巣皮質組織を得るために卵胞穿刺または手術などの侵襲的処置を受けなければならないという事実である。したがって、女性の配偶子は研究目的で入手することは困難です。
現在、TS15の若い女性における卵巣組織凍結保存の有効性を調査するために、オランダで観察介入研究が行われています。患者の卵巣皮質組織の1つの断片は、卵巣細胞のX染色体含量を同定するために利用可能であった16、17。研究の一環として、解離した卵巣皮質組織のFISHに基づいて、リンパ球や頬細胞などの非卵巣体細胞に染色体異常がある女性の卵巣細胞に染色体異常が存在するかどうかを判断する新しい方法が開発されました。さらに、卵胞形成に対する卵巣細胞の異数性の影響も決定されました。この目的のために、確立されたFISHプロトコルが変更され、免疫不全マウスの長期異種移植中に人為的に誘導された卵胞形成後の卵巣皮質組織の組織学的切片の分析が可能になりました。本研究では、X染色体異常を有する雌の非移植および移植卵巣皮質組織の卵巣細胞におけるX染色体含量を決定するためのFISHに基づく2つの方法を提示し、このトピックに関する基礎科学の向上を目指します。
Protocol
Representative Results
Discussion
FISH分析は、男性と女性の両方のリンパ球または頬側細胞のX染色体異常を検出するためのよく知られた技術です10。いくつかの研究では、X染色体異常のある男性の配偶子に関するFISHが説明されていますが、X染色体異常のある女性の卵巣細胞に関するFISHによって得られた詳細な情報はまだ不足しています14。この記事では、X染色体異常の女性の非移植およ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、マルジョ・ヴァン・ブラーケル、ドミニク・スミーツ、ギヨーム・ファン・デ・ザンデ、パトリシア・ファン・クリーフ、ミラン・インテザールの専門知識と技術支援を認めています。資金源:メルクセローノ(A16-1395)、グッドライフ、フェリング。
Materials
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
Riferimenti
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