Erforschung von X-Chromosomen-Aberrationen in Ovarialzellen durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
Summary
In diesem Artikel werden zwei Methoden vorgestellt, die auf der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung basieren, um den X-chromosomalen Gehalt von Ovarialzellen di nicht transplantiertem und transplantiertem Ovarialrindengewebe von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu bestimmen.
Abstract
Millionen von Menschen weltweit beschäftigen sich mit Fragen der Fruchtbarkeit. Eine verminderte Fruchtbarkeit oder sogar Unfruchtbarkeit kann auf viele verschiedene Ursachen zurückzuführen sein, einschließlich genetischer Störungen, von denen Chromosomenanomalien die häufigsten sind. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine bekannte und häufig eingesetzte Methode zum Nachweis von Chromosomenaberrationen beim Menschen. FISH wird hauptsächlich für die Analyse von Chromosomenanomalien in den Spermien von Männern mit numerischen oder strukturellen Chromosomenaberrationen verwendet. Darüber hinaus wird diese Technik auch häufig bei Frauen angewendet, um X-Chromosomenaberrationen zu erkennen, von denen bekannt ist, dass sie eine ovarielle Dysgenesie verursachen. Es fehlen jedoch noch Informationen über den X-Chromosomen-Gehalt von Eierstockzellen von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen in Lymphozyten und/oder Wangenzellen.
Ziel dieser Studie ist es, die Grundlagenforschung zu X-Chromosomenaberrationen bei Frauen voranzutreiben, indem zwei auf FISH basierende Methoden zur Bestimmung des X-chromosomalen Gehalts von Ovarialzellen vorgestellt werden. Zunächst wird eine Methode beschrieben, mit der der X-Chromosomengehalt von isolierten Ovarialzellen (Eizellen, Granulosazellen und Stromazellen) in nicht transplantiertem Ovarialrindengewebe von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen bestimmt werden kann. Die zweite Methode zielt darauf ab, die Wirkung von Chromosomenaberrationen auf die Follikulogenese zu bewerten, indem der X-Chromosomengehalt von Eierstockzellen neu gebildeter sekundärer und antraler Follikel im Eierstockgewebe von Weibchen mit X-Chromosomenaberrationen nach Langzeittransplantation in immungeschwächte Mäuse bestimmt wird. Beide Methoden könnten in der zukünftigen Forschung hilfreich sein, um Einblicke in das Fortpflanzungspotenzial von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu erhalten.
Introduction
Unfruchtbarkeit ist ein Gesundheitsproblem des männlichen oder weiblichen Fortpflanzungssystems, von dem weltweit etwa 186 Millionen Menschen im gebärfähigen Alter betroffen sind1. Bei mindestens 35 % der unfruchtbaren Paare wird die Unfruchtbarkeit durch eine Störung des weiblichen Fortpflanzungssystems verursacht2. Es gibt viele Faktoren, die weibliche Unfruchtbarkeit verursachen können, wie z. B. genetische Faktoren, Anomalien des Genitaltrakts, endokrine Dysfunktion, entzündliche Erkrankungen und iatrogene Behandlung3.
Genetische Anomalien liegen bei etwa 10 % der unfruchtbaren Frauen vor 4,5. Von allen genetischen Anomalien sind X-Chromosomen-Aberrationen die häufigste Ursache für die Ovarialdysgenesie2. Mehrere Studien haben berichtet, dass X-Chromosomenaberrationen bei Frauen mit Turner-Syndrom (TS) oder Triple-X-Syndrom mit vorzeitiger Ovarialinsuffizienz aufgrund eines beschleunigten Verlusts von Keimzellen oder einer gestörten Oogenese assoziiert sind 6,7,8.
Aberrationen des X-Chromosoms können unterteilt werden in: 1) numerische Aberrationen, bei denen die Anzahl der X-Chromosomen unterschiedlich ist, aber die X-Chromosomen intakt sind; und 2) strukturelle Aberrationen, bei denen das X-Chromosom genetisches Material gewonnen oder verloren hat 3,9. Numerische Aberrationen des X-Chromosoms sind häufiger als strukturelle Anomalien und werden häufig durch spontane Fehler bei der Zellteilung verursacht 3,9. Wenn ein solcher Fehler während der Meiose auftritt, kann er zu aneuploiden Gameten und schließlich zu Nachkommen mit Chromosomenaberrationen in allen Zellen führen. Wenn Chromosomendefekte in somatischen Zellen als Folge von Fehlern während der Mitose in frühen Stadien der Ontogenese auftreten, kann dies zu Mosaizismus führen. Bei diesen Personen sind sowohl Zellen mit normalem X-Chromosomengehalt als auch Zellen mit X-Chromosomenaberrationen vorhanden.
In den 1980er Jahren wurde eine zytogenetische Technik namens Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) entwickelt, um spezifische Nukleinsäuresequenzen auf Metaphase- und Interphase-Chromosomen sichtbar zu machen und zu lokalisieren 10,11. Bei dieser Technik werden fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden verwendet, um an eine bestimmte Sequenz im Chromosom zu binden, die dann mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden kann.
Heutzutage ist FISH als klinisches Diagnoseinstrument weit verbreitet und gilt als Goldstandard bei der Erkennung von Chromosomenaberrationen10. Im Bereich der Reproduktionsmedizin wurde die FISH-Analyse an Spermien eingesetzt, um Einblicke in den X-chromosomalen Gehalt von Spermien bei Männern mit numerischen oder strukturellen Chromosomenaberrationen in somatischen Zellen zu erhalten12,13,14. Diese Studien zeigten, dass Männer mit Chromosomenaberrationen mit größerer Wahrscheinlichkeit eine höhere Häufigkeit von aneuploiden Spermien in ihrem Sperma aufwiesen als Männer mit normalen Karyotypen12,13,14.
Im Gegensatz zu den Spermien ist nur sehr wenig über den X-chromosomalen Gehalt von Eierstockzellen (einschließlich Eizellen, Granulosa/Theka-Zellen und Stromazellen) bei Personen mit einer Chromosomenaberration sowie über die möglichen Folgen einer Aneuploidie dieser Zellen auf ihr Fortpflanzungspotenzial bekannt. Ein wichtiger Grund für die geringen Informationen über den Karyotyp von Eierstockzellen im Vergleich zu Spermien ist die Tatsache, dass sich Frauen einem invasiven Eingriff wie einer Follikelpunktion oder einer Operation unterziehen müssen, um Eizellen oder Gewebe der Eierstockrinde zu gewinnen. Weibliche Gameten sind daher für Forschungszwecke nur schwer zu beschaffen.
Derzeit wird in den Niederlanden eine Interventionsstudie durchgeführt, um die Wirksamkeit der Kryokonservierung von Eierstockgewebe bei jungen Frauen mit TS15 zu untersuchen. Ein Fragment des Gewebes der Ovarialrinde der Patientin stand zur Verfügung, um den X-chromosomalen Gehalt der Ovarialzellen zu bestimmen16,17. Im Rahmen der Studie wurde eine neuartige Methode entwickelt, die auf FISH von dissoziiertem Ovarialrindengewebe basiert, um festzustellen, ob Chromosomenaberrationen in Ovarialzellen bei Frauen vorhanden sind, die eine Chromosomenaberration in nicht-ovariellen somatischen Zellen wie Lymphozyten oder Wangenzellen aufweisen. Darüber hinaus wurde auch der Effekt der Aneuploidie in Ovarialzellen auf die Follikulogenese bestimmt. Zu diesem Zweck wurde ein etabliertes FISH-Protokoll modifiziert, das die Analyse histologischer Schnitte von Ovarialrindengewebe nach künstlich induzierter Follikulogenese während der Langzeit-Xenotransplantation bei immungeschwächten Mäusen ermöglicht. In dieser Studie stellen wir zwei auf FISH basierende Methoden vor, um den X-chromosomalen Gehalt in Ovarialzellen in nicht transplantiertem und transplantiertem Ovarialrindengewebe bei Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu bestimmen, mit dem Ziel, die Grundlagenforschung zu diesem Thema zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die FISH-Analyse ist eine bekannte Technik zum Nachweis von X-Chromosomenaberrationen in Lymphozyten oder Wangenzellen sowohl von Männern als auch von Frauen10. Mehrere Studien haben FISH an Gameten von Männern mit X-Chromosomenaberrationen beschrieben, aber es fehlen noch detaillierte Informationen, die FISH an Eierstockzellen von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen gewonnen hat14. In diesem Artikel werden neue Methoden vorgestellt, die auf FISH basieren, um festzustell…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef und Milan Intezar für ihr Fachwissen und ihre technische Unterstützung. Finanzierungsquellen: Merck Serono (A16-1395), Goodlife und Ferring.
Materials
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
Riferimenti
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