Explorer les aberrations chromosomiques X dans les cellules ovariennes en utilisant l’hybridation in situ par fluorescence
Summary
Cet article présente deux méthodes basées sur l’hybridation in situ par fluorescence pour déterminer le contenu chromosomique X des cellules ovariennes dans le tissu du cortex ovarien non greffé et greffé de femelles présentant des aberrations chromosomiques X.
Abstract
Des millions de personnes dans le monde sont confrontées à des problèmes de fertilité. La baisse de la fertilité, voire l’infertilité, peut être due à de nombreuses causes différentes, y compris des troubles génétiques, dont les anomalies chromosomiques sont les plus courantes. L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une méthode bien connue et fréquemment utilisée pour détecter les aberrations chromosomiques chez l’homme. FISH est principalement utilisé pour l’analyse des anomalies chromosomiques dans les spermatozoïdes des mâles présentant des aberrations chromosomiques numériques ou structurelles. En outre, cette technique est également fréquemment appliquée chez les femmes pour détecter les aberrations chromosomiques X connues pour causer la dysgénésie ovarienne. Cependant, les informations sur le contenu chromosomique X des cellules ovariennes de femelles présentant des aberrations chromosomiques X dans les lymphocytes et / ou les cellules buccales font encore défaut.
Le but de cette étude est de faire progresser la recherche fondamentale sur les aberrations chromosomiques X chez les femelles, en présentant deux méthodes basées sur FISH pour identifier le contenu chromosomique X des cellules ovariennes. Tout d’abord, une méthode est décrite pour déterminer le contenu chromosomique X de cellules ovariennes isolées (ovocytes, cellules de la granulosa et cellules stromales) dans le tissu du cortex ovarien non greffé de femelles présentant des aberrations chromosomiques X. La deuxième méthode vise à évaluer l’effet des aberrations chromosomiques sur la folliculogenèse en déterminant le contenu chromosomique X des cellules ovariennes des follicules secondaires et antraux nouvellement formés dans le tissu ovarien, à partir de femelles présentant des aberrations chromosomiques X après greffe à long terme chez des souris immunodéprimées. Les deux méthodes pourraient être utiles dans les recherches futures pour mieux comprendre le potentiel de reproduction des femelles présentant des aberrations chromosomiques X.
Introduction
L’infertilité est un problème de santé du système reproducteur masculin ou féminin, affectant environ 186 millions de personnes en âge de procréer dans le monde1. Chez au moins 35% des couples infertiles, l’infertilité est causée par un trouble du système reproducteur féminin2. De nombreux facteurs peuvent causer l’infertilité féminine, tels que des facteurs génétiques, des anomalies des voies génitales, un dysfonctionnement endocrinien, des maladies inflammatoireset un traitement iatrogène3.
Des anomalies génétiques sont présentes chez environ 10 % des femelles infertiles 4,5. De toutes les anomalies génétiques, les aberrations du chromosome X sont la cause la plus fréquente de dysgénésie ovarienne2. Plusieurs études ont rapporté que les aberrations chromosomiques X chez les femmes atteintes du syndrome de Turner (TS) ou du syndrome Triple X sont associées à une insuffisance ovarienne prématurée due à une perte accélérée de cellules germinales ou à une altération de l’oogenèse 6,7,8.
Les aberrations du chromosome X peuvent être divisées en: 1) aberrations numériques, dans lesquelles le nombre de chromosomes X est différent mais les chromosomes X sont intacts; et 2) les aberrations structurelles, dans lesquelles le chromosome X a gagné ou perdu du matériel génétique 3,9. Les aberrations numériques du chromosome X sont plus fréquentes que les anomalies structurelles et sont souvent causées par des erreurs spontanées lors de la division cellulaire 3,9. Lorsqu’une telle erreur se produit pendant la méiose, elle peut conduire à des gamètes aneuploïdes et finalement à une progéniture avec des aberrations chromosomiques dans toutes les cellules. Lorsque des défauts chromosomiques apparaissent dans les cellules somatiques à la suite d’erreurs survenant pendant la mitose dans les premiers stades de l’ontogenèse, cela peut conduire au mosaïcisme. Chez ces individus, les cellules ayant un contenu chromosomique X normal et les cellules présentant des aberrations chromosomiques X sont présentes.
Dans les années 1980, une technique cytogénétique appelée hybridation in situ par fluorescence (FISH) a été développée pour visualiser et localiser des séquences d’acides nucléiques spécifiques sur les chromosomes métaphasiques et interphasiques10,11. Cette technique utilise des sondes d’ADN marquées par fluorescence pour se lier à une séquence spécifique du chromosome, qui peut ensuite être visualisée à l’aide d’un microscope à fluorescence.
De nos jours, FISH est largement utilisé comme outil de diagnostic clinique et est considéré comme l’étalon-or dans la détection des aberrations chromosomiques10. Dans le domaine de la médecine de la reproduction, l’analyse FISH sur le sperme a été utilisée pour mieux comprendre le contenu chromosomique X des spermatozoïdes chez les mâles présentant des aberrations chromosomiques numériques ou structurelles dans les cellules somatiques12,13,14. Ces études ont montré que les hommes présentant des aberrations chromosomiques étaient plus susceptibles d’avoir une fréquence plus élevée de spermatozoïdes aneuploïdes présents dans leur sperme par rapport aux hommes ayant des caryotypesnormaux 12,13,14.
Contrairement aux spermatozoïdes, on sait très peu de choses sur le contenu chromosomique X des cellules ovariennes (y compris les ovocytes, les cellules granulosa / thèques et les cellules stromales) chez les individus présentant une aberration chromosomique, ainsi que sur les conséquences possibles de l’aneuploïdie de ces cellules sur leur potentiel de reproduction. Une raison importante pour le peu d’informations sur le caryotype des cellules ovariennes par rapport aux spermatozoïdes est le fait que les femmes doivent subir une procédure invasive telle qu’une ponction de follicule ou une intervention chirurgicale pour obtenir des ovocytes ou du tissu du cortex ovarien. Les gamètes femelles sont donc difficiles à obtenir à des fins de recherche.
Actuellement, une étude d’intervention observationnelle est en cours aux Pays-Bas pour explorer l’efficacité de la cryoconservation du tissu ovarien chez les jeunes femmes atteintes de TS15. Un fragment du tissu du cortex ovarien de la patiente était disponible pour identifier le contenu chromosomique X des cellules ovariennes16,17. Dans le cadre de l’étude, une nouvelle méthode a été développée basée sur FISH du tissu dissocié du cortex ovarien pour déterminer si des aberrations chromosomiques sont présentes dans les cellules ovariennes chez les femelles porteuses d’une aberration chromosomique dans les cellules somatiques non ovariennes, telles que les lymphocytes ou les cellules buccales. En outre, l’effet de l’aneuploïdie dans les cellules ovariennes sur la folliculogenèse a également été déterminé. À cette fin, un protocole FISH établi a été modifié qui permet l’analyse de coupes histologiques de tissu du cortex ovarien après folliculogenèse induite artificiellement pendant la xénotransplantation à long terme chez des souris immunodéprimées. Dans cette étude, nous présentons deux méthodes basées sur FISH pour déterminer le contenu chromosomique X dans les cellules ovariennes dans le tissu du cortex ovarien non greffé et greffé chez les femmes présentant des aberrations chromosomiques X, dans le but d’améliorer la science fondamentale sur ce sujet.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse FISH est une technique bien connue pour détecter les aberrations chromosomiques X dans les lymphocytes ou les cellules buccales des mâles et des femelles10. Plusieurs études ont décrit FISH sur des gamètes de mâles présentant des aberrations chromosomiques X, mais les informations détaillées obtenues par FISH sur les cellules ovariennes de femelles présentant des aberrations chromosomiques X font encore défaut14. Cet article présente de nouvelles mé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef et Milan Intezar pour leur expertise et leur assistance technique. Sources de financement : Merck Serono (A16-1395), Goodlife et Ferring.
Materials
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
Riferimenti
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