Summary
本文介绍了听觉脑干反应波形中前五个波峰和波谷的振幅和延迟的半自动测量。一个额外的例程将数据编译并注释到电子表格中，以供实验者分析。这些免费的计算机例程是使用开源统计包R执行的。
Abstract
过去15年中的许多报告都评估了噪声暴露等侮辱后听觉脑干反应（ABR）波形的变化。常见的变化包括峰1幅度的降低和后面峰值的相对延迟，以及中心增益的增加，这反映在与峰值1的幅度相比，后面峰值的幅度相对增加。许多实验人员通过视觉识别峰值和波谷以评估它们的相对高度和延迟，当每个频率和条件在整个听觉范围内以5 dB的增量收集波形时，这是一个费力的过程。本文介绍了可以在开源平台 R 中使用 RStudio 接口执行的自由例程，以半自动测量听觉脑干响应 （ABR） 波形的峰值和波谷。这些例程识别波峰和波谷的幅度和延迟，将其显示在生成的波形上以供检查，将结果整理并注释到电子表格中进行统计分析，并生成数字的平均波形。如果自动化过程错误地识别了 ABR 波形，则还有一个额外的工具可以帮助校正。目标是减少分析ABR波形所需的时间和精力，以便将来更多的研究人员将这些分析包括在内。
Introduction
听觉脑干反应（ABR）经常用于确定动物受试者和人类婴儿的听力阈值。由于 ABR 是神经系统对听觉刺激的首次反应的脑电图 （EEG） 记录，因此它携带额外的信息，反映耳蜗螺旋神经节神经元的协调放电和听觉脑干中的早期信号处理，包括双侧处理1。这些反应可能会受到噪音创伤的影响。例如，足以诱导小鼠暂时阈值偏移的噪声暴露也可以永久降低ABR峰12的振幅。此外，这种创伤可能会降低峰间潜伏期并增加后期峰3的相对振幅，这可能是由于抑制调节4的丧失。除了这些发现之外，特定的基因突变已被证明可以在没有创伤的情况下改变ABR波形5，6，7。因此，ABR波形的常规分析可以提供对实验模型中听觉系统的洞察。
人们也有兴趣使用ABR波形作为患者的诊断工具。以前的报告已经评估了人类患者在暴露于噪音后或耳鸣患者的ABR峰值1是否降低8，9。值得注意的是，据报道，偏头痛发作会暂时增加高峰间延迟数周，之后受影响个体的 ABR 波形恢复正常10。据报道，COVID-19 会导致 ABR 峰间延迟的长期变化11，12，尽管另一项研究报告了不同的结果 13。听力损失通常与衰老中的痴呆同时存在，听力损失较大的人往往会经历进展更快的痴呆14。研究人员研究了神经退行性疾病的ABR波形变化，例如帕金森病（在Jafari等人15中审查）和阿尔茨海默病（在Swords等人16中审查），以及正常衰老17。随着越来越多的研究人员和临床医生研究感觉缺陷作为衰老常见疾病的生物标志物，ABR等技术可能会成为医疗保健中的常规。
对文献中方法部分的检查表明，实验室经常在 MatLab 中编写自定义脚本来分析 ABR 波形。智能听力系统制造的ABR平台具有波形分析功能，但需要操作员手动选择波峰和波谷。在这里，我们为开源、免费提供的统计环境 R 和 RStudio 接口编写了半自动分析例程。该报告将使用我们的例程获得的数据与通过让实验者手动识别峰值和波谷获得的数据进行比较，并表明来自两种方法的数据具有很强的相关性。重要的是，这些例程包含一个盲法功能，其中样本的元数据被放置在一个单独的文件中，直到最后才合并。这些功能简化了我们实验室的波形分析。
Protocol
对动物进行的所有程序都事先得到了罗切斯特大学动物研究委员会的批准。实验对象是12只1个月大的野生型F1雄性和雌性小鼠。这些F1小鼠是CBA / CaJ母星和C57BL / 6J公猪交配的产物。小鼠在动物饲养设施中繁殖和饲养，具有标准的12小时光照/黑暗循环，无限量的食物和水以及充足的筑巢用品。不超过五个同性兄弟姐妹被关在一个笼子里。
1. 获取数据进行分析
注意：此步骤必须符合机构指南，并得到机构动物福利委员会的预先批准。从小鼠生成ABR数据的详细过程已在别处描述18。
- 使用所选平台记录 ABR。
注意：在此处显示的实例中，记录是在小鼠上进行的。- 使用 5 毫秒的点击激励，从 75 dB 声压级开始，以 5 dB 的步长递减至 5 dB。每个振幅平均记录 512 次扫描。如果在激励后1.3 ms至12.5 ms之间的任何实例中，峰值到谷值幅度大于31 μV，则拒绝响应。
注意：也可以使用来自音点演示的录音。我们预计分析程序将适用于其他物种，包括人类。
- 使用 5 毫秒的点击激励，从 75 dB 声压级开始，以 5 dB 的步长递减至 5 dB。每个振幅平均记录 512 次扫描。如果在激励后1.3 ms至12.5 ms之间的任何实例中，峰值到谷值幅度大于31 μV，则拒绝响应。
- 将 ABR 记录导出为 ASCII 文件。
- 对于 IHS，请打开计算机程序。
- 加载感兴趣的文件，并在一页上显示所需的波形。
- 在 “数据 ”选项卡下，选择“ 将页面另存为 ASCII ”以获取.txt文件。
- 正确命名数据文件（“ID”）后，将 ID 和主题信息记录在名为“info.csv”的元数据文件中。确保“ID”不包含任何信息，例如基因型、性别、年龄或治疗;此信息改为记录在“信息.csv中。
注意：如果需要，可以使用一副公平的扑克牌来随机分配标签。 - 对所有要分析的文件作为单独的“ID”文件重复此操作。
2. 安装所需的软件包并将数据加载到工作计算机上
- 下载并安装 R （https://www.r-project.org） 和 RStudio （https://www.rstudio.com）。
注意：此处描述的协议使用 R ≥ 4.0.0。 - 通过在 RStudio 的命令窗口中键入以下命令来安装所需的库、 整洁、 闪亮、 绘图和 动物园：
Install.packages（“tidyverse”）
Install.packages（“shiny”）
Install.packages（“plotly”）
Install.packages（“zoo”） - 下载 脚本 FindPeaks.R 和 See_trace_click。来自 White lab GitHub （https://github.com/PWhiteLab/FindPeaks） 的 R，以及相关文件“Time.csv”。
- 创建一个新文件夹以包含所有 ASCII 文件、“info.csv”和“Time.csv”。对于此示例，请将文件夹命名为“Test_Folder”。在“Test_Folder”中，将 ASCII 文件放在名为“ASCII_Folder”的子文件夹中。
3. 通过FindPeaks.R获得初步分析
- 在 RStudio 中打开 FindPeaks.R 脚本。
- 右键单击工具栏中 脚本 的选项卡，选择 “设置工作目录”，并将其设置为 “Test_Folder ”（请参阅 补充图 S1A）。
- 在 脚本 窗口中，单击工具栏右上角的 “源 ”以加载程序（请参阅 补充图 S1B）。
- 在命令窗口中，使用以下命令分析波形（参见 补充图S2）：
单个文件的FindPeaks_single（“ASCII_folder/ID.txt”） （见 补充图S2A）
FindPeaks_group（“ASCII_Folder”） 用于批处理（见 补充图S2B）
注意：该脚本将输出 （1） pdf 文件，显示带有标记波峰和波谷的波形（参见 补充图 S2C）和 （2） 包含幅度 （μV） 和延迟 （ms） 数值数据的 ID.csv 文件。这两个文件都将放在“Test_Folder”中。
4. 验证初步分析
注意：在低声级下，波形的某些部分可能难以与噪声区分开来，并且与实验者的意见相比，FindPeaks.R可能会错误地识别峰值或波谷。如果存在差异，则可以使用从脚本 See_trace_click.R 获得的数据修改.csv文件。
- 使用以下命令加载特定个人的波形数据（参见 补充图S3A）：
波形 <- ASCII_extract（“ASCII_Folder/ID.txt”） - 打开See_trace_click。RStudio 中的 R 脚本。
- 在左侧的标题中，单击“ 运行应用 ”按钮，然后等待新的交互式（闪亮）窗口出现（请参阅 补充图 S3B）。
- 在左上角的框中，输入需要修改的波形的声级，然后查找窗口中显示的波形。
- 在波形周围移动光标以显示任何点的延迟和幅度。
- 单击 正确的峰值和以下波谷 以记录下表中的数据。将 延迟数据 复制并粘贴到.csv文件中（请参阅 补充图 S3C）。
- 要计算振幅测量值，请 从电子表格单元格中的峰值振幅中减去以下波谷振幅。
5. 编译和可视化数据集
- 将已验证的.csv文件传输到标题为“Peak_Data”的Test_Folder的新子文件夹。
- 将数据追加到单个.csv文件中，并将其命名为“Peak_Data.csv”。
- 使用以下命令：
编译（“Peak_Data”）
注意：此脚本将来自 info.csv 的元数据与Peak_Data.csv相结合，以使用组信息标记数据。它还会自动计算峰间延迟和幅度比。 - 对编译的数据进行统计分析。
- 使用以下函数使用正态性检验（如夏皮罗-威尔克斯检验）来评估数据的分布：
夏皮罗测试（） - 如果夏皮罗-威尔克斯检验不显著，则数据集具有正态分布;因此，使用参数检验（如具有以下函数的方差分析）评估数据：
AOV（） - 如果夏皮罗-威尔克斯检验小于 p = 0.05，请使用Kruskal-Wallis秩和检验（具有下面的函数）或其他适当的非参数度量（请参阅讨论中的其他可能性）。
kruskal.test（）
- 使用以下函数使用正态性检验（如夏皮罗-威尔克斯检验）来评估数据的分布：
- 要显示平均波形，请使用以下命令：
Average_Waveform（“ASCII_Folder ”， aes（x = Data_Pnt_ms， y = “dB”， 组 = 基因型， 颜色 = 基因型））
注意：此命令显示不同颜色的不同基因型的平均波形。对于 y 变量 dB，插入与 所需振幅对应的数字，例如 75，不带引号。对于其他比较，请使用元数据中的相应 组标签 。
Representative Results
我们测试了对点击序列的ABR波形响应的例程，从75 dB开始，以5 dB的增量降压至5 dB。这些数据如前面描述的19获得。我们还在音调点数据上测试了该工具，并获得了类似的结果。大多数 ABR 系统的 ABR 数据可以导出为.txt （ASCII） 文件。我们将 ABR ASCII 文件加载到计算机上，并在 RStudio 中打开它们，如协议中所述。在批量运行FindPeaks.R例程后，我们获得了带有自动标记的样本波形（图1）和包含结果的.csv文件。对结果进行评价，以去除不相关的峰。为了验证自动标记，我们还使用ABR程序功能手动标记通过上述点击系列获得的每个波形上的前五个波峰和波谷。执行此任务的实验者具有2年记录和分析ABR数据的经验。 图 2 显示了这种比较，自动 FindPeaks.R 数据为红色，手动获得的数据为黑色。每条跟踪表示来自单个鼠标的数据。还显示了具有一个标准差的两种方法的平均值。FindPeaks.R获得的结果与手动获得的结果密切相关（见 补充图S4）。
图 1：年轻 F1 鼠标对 75 dB 点击激励的代表性波形响应。 延迟（以毫秒为单位）绘制在 x 轴上，以微伏为单位的幅度绘制在 y 轴上。峰用FindPeaks.R自动识别并标记为红色，而波谷标记为蓝色。 请点击此处查看此图的大图。
图2：从手动识别的峰获得的数据与FindPeaks.R分析提供的数据的比较。 （A，C，E，G，I）以微伏为单位的幅度和（B，D，F，H，J）延迟（以毫秒为单位）绘制在5 dB和75 dB之间的声级（x轴，所有图形）对于为呈现给12只小鼠的点击刺激获得的波形中的峰值I-V。将手动获得的值（黑色）与使用FindPeaks.R（红色）分析的相同数据集进行比较。平均值绘制为粗线，阴影区域表示一个标准差。当用Kruskal-Wallis秩和检验评估时，方法之间没有差异（A，差异= 0.0547977±0.0010028，最大值= 0.96，p = 0.9216;B， 差值 = −0.0001734 ± 0.0001214， max = 0.04， p = 0.8289;C， 差值 = −0.0212209 ± 0.0006806， max = 0.92， p = 0.9687;D， 差值 = −0.0011047 ± 0.0001556， max = 0.06， p = 0.771;E， 差值 = −0.0323077 ± 0.0006169， 最大值 = 0.66， p = 0.899;F， 差值 = −0.0072189 ± 0.0001460， max = 0.04， p = 0.8644;G，差值 = 0.201754 ± 0.0007407，最大值 = 0.64，p = 0.9312;H， 差值 = −0.0007018 ± 0.0001717， max = 0.09， p = 0.8013;I， 差值 = 0.0347561 ± 0.0007343， max = 1.05， p = 0.8856;J，差值 = −0.0078049 ± 0.0002762，最大值 = 0.16，p = 0.886），结果高度相关（卡方值：A，0.009696;B， 0.046684;C， 0.0015395;D， 0.084742;E， 0.016102;F， 0.029153;G， 0.0074604;H， 0.063322;I， 0.020699;J， 0.020544;差异表示为平均± SEM;最大值 = 绝对最大值差值）。请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：使用FindPeaks.R进行分析 （A）选择工作目录（见协议步骤3.2）;（B）加载程序（参见协议步骤3.3）。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：用于分析波形的脚本输出和命令。 用于 （A） 单个文件和 （B） 批处理的命令。（C） 输出PDF文件，显示带有标记波峰和波谷的波形。请参阅协议步骤 3.4。 请点击此处下载此文件。
补充图S3：分析的验证。 （A） 加载波形数据（参见协议步骤4.1）。（b） “运行应用 ”按钮的位置。还指示了示例数据文件。（C） 带有波形的 反光 窗口。在本例中，在顶部窗口中输入的声级为 75 dB。单击所需的峰值和以下波谷在表中记录幅度和延迟的数据（协议步骤4.6）。显示峰值 3 数据。 请点击此处下载此文件。
补充图S4：从手动识别峰获得的单个数据与FindPeaks.R分析提供的数据的比较。 （A，C，E，G，I）绘制以微伏为单位的振幅和（B，D，F，H，J）延迟（以毫秒为单位）的声级，用于5 dB至75 dB（x轴，所有图形）之间的声级，用于为呈现给12只小鼠的点击刺激获得的波形中的峰值I-V。每只动物都标有独特的颜色，如图例所示。使用FindPeaks.R获得的数据用纯色标记，而手动获得的数据用相同颜色的饱和度较低的版本标记。虽然两个数据集都绘制在此图中，但当它们相同时，只有一条线是明显的。 请点击此处下载此文件。
Discussion
本出版物中描述的协议应有助于简化描述ABR到咔嗒声和音调点的电压幅度比和延迟间隔的数据的采集。通过在 RStudio 中使用单个命令，实验者可以在单个文档中提取、编译和显示此信息以进行统计分析。通过使这种分析成为常规，我们希望该领域能够发现新的方法，使ABR在不同物种的发育，衰老或侮辱中被改变。这些信息对于从噪声2中识别类似于突触病的重要机制可能很有价值。用于该实验的年轻小鼠具有高度可变的反应，可能是因为听觉脑干在20岁时仍在成熟。尽管如此，这两种定量方法显示出非常强的相关性（图2）。
该脚本使用名为“Time.csv”的文件在数据中设置间隔以进行峰值识别。简而言之，在指定时间间隔内发生的最大电压幅度标记为“峰值1”，在下一个时间间隔内发生的最大电压幅度标记为“波谷1”，依此类推。我们选择的间隔包括1个月至12个月大的CBA / CaJ小鼠的点击和音调点响应的延迟，频率范围为8 kHz至32 kHz。我们成功地使用该工具测量了小鼠的音调点反应。其他物种，包括人类，在类似的窗口中也有ABR反应，我们预计该工具也可以用于其他物种的数据。我们建议对人类21使用新的并行ABR方法，该方法可产生出色的波形。时间间隔限制将此工具的使用限制为评估即时 ABR 响应。但是，我们注意到，用户可以更改此文件中的间隔数据，以自动测量ABR对语音的响应或事件相关电位（ERP），这些电位通常在响应声音的不同时间发生。
对这些数据进行统计处理的一些特点值得强调。据我们所知，该领域没有用于区分振幅级数的标准化处理方法。早期研究使用方差分析22，23。此处点击系列的数据（图 2）是非参数的，因此使用了 Kruskal-Wallis 秩和检验。与方差分析类似，克鲁斯卡尔-瓦利斯秩和检验评估在给定刺激水平下获得的值的差异;也就是说，它比较在图形上获得的线。但是，其他治疗方法也是可能的。从生物学上讲，振幅进展反映了随着刺激水平的增加，更高阈值神经元的额外募集。这表明曲线下的面积（代表线的积分）可能是更相关的度量。广义估计方程（GEE）可用于对单个数据进行积分分析建模，如Patel等人5。值得注意的是，GEE分析可以考虑这些实验的重复措施设计。随着越来越多的研究人员讨论数据分析方法，我们预计会出现关于最佳实践的共识。
总之，本文介绍了用于测量、编译和可视化 ABR 波形的免费且易于使用的工具。这些工具可以由RStudio的新手学生通过遵循此协议使用，并且它们包含一个盲法步骤以提高严谨性和可重复性。我们预计，常规的ABR波形分析将能够发现侮辱，遗传变异和其他可能影响听觉功能的治疗方法。
Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了NIDCD向PW提供的两项赠款的支持：R01 DC018660和行政补充奖R01 DC014261-05S1。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 664 | |
| CBA/CaJ mice | Jackson Labs | 654 | |
| E-series PC | Dell | n/a (this equipment was discontinued) | This runs the IHS system. |
| Mini-anechoic chamber | Industrial Acoustics Company | Special order number 104306 | This enclosure reduces noise levels for auditory testing of animals. |
| Optiplex 7040 | Dell | i5-6500 | Rstudio may also be run on a Mac or Linux system. |
| Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | n/a (this equipment was discontinued) | Both TDT and IHS can output hearing data as ASCII files. |
References
- Gopal, K. V., Pierel, K. Binaural interaction component in children at risk for central auditory processing disorders. Scandinavian Audiology. 28 (2), 77-84 (1999).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: Cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Salvi, R. J., Wang, J., Ding, D. Auditory plasticity and hyperactivity following cochlear damage. Hearing Research. 147 (1-2), 261-274 (2000).
- Schrode, K. M., Muniak, M. A., Kim, Y. H., Lauer, A. M. Central compensation in auditory brainstem after damaging noise exposure. eNeuro. 5 (4), (2018).
- Patel, S., et al. SIRT3 promotes auditory function in young adult FVB/nJ mice but is dispensable for hearing recovery after noise exposure. PLoS One. 15 (7), 0235491 (2020).
- Milinkeviciute, G., Chokr, S. M., Castro, E. M., Cramer, K. S. CX3CR1 mutation alters synaptic and astrocytic protein expression, topographic gradients, and response latencies in the auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 529 (11), 3076-3097 (2021).
- Ison, J. R., Allen, P. D., Oertel, D. Deleting the HCN1 subunit of hyperpolarization-activated ion channels in mice impairs acoustic startle reflexes, gap detection, and spatial localization. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 427-440 (2017).
- Chen, F., Zhao, F., Mahafza, N., Lu, W. Detecting noise-induced cochlear synaptopathy by auditory brainstem response in tinnitus patients with normal hearing thresholds: A meta-analysis. Frontiers in Neuroscience. 15, 778197 (2021).
- Santos-Filha, V. A., Samelli, A. G., Matas, C. G. Noise-induced tinnitus: Auditory evoked potential in symptomatic and asymptomatic patients. Clinics. 69 (7), 487-490 (2014).
- Kochar, K., Srivastava, T., Maurya, R. K., Jain, R., Aggarwal, P. Visual evoked potential & brainstem auditory evoked potentials in acute attack & after the attack of migraine. Electromyography and Clinical Neurophysiology. 42 (3), 175-179 (2002).
- Gedik, O., Husam, H., Basoz, M., Tas, N., Aksoy, F. The effect of coronavirus disease 2019 on the hearing system. Journal of Laryngology and Otology. 135 (9), 810-814 (2021).
- Ozturk, B., Kavruk, H., Aykul, A. Audiological findings in individuals diagnosed with COVID-19. American Journal of Otolaryngology. 43 (3), 103428 (2022).
- Dror, A. A., et al. Auditory performance in recovered SARS-COV-2 patients. Otology & Neurotology. 42 (5), 666-670 (2021).
- Lin, F. R., et al. Hearing loss and incident dementia. Archives of Neurology. 68 (2), 214-220 (2011).
- Jafari, Z., Kolb, B. E., Mohajerani, M. H.
- Swords, G. M., Nguyen, L. T., Mudar, R. A., Llano, D. A. Auditory system dysfunction in Alzheimer disease and its prodromal states: A review. Ageing Research Reviews. 44, 49-59 (2018).
- Konrad-Martin, D., et al. Age-related changes in the auditory brainstem response. Journal of the American Academy of Audiology. 23 (1), 18-35 (2012).
- Navntoft, C. A., Marozeau, J., Barkat, T. R. Cochlear implant surgery and electrically-evoked auditory brainstem response recordings in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e59073 (2019).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7, 1054 (2017).
- Rubio, M. E. Auditory brainstem development and plasticity. Current Opinion in Physiology. 18, 7-10 (2020).
- Polonenko, M. J., Maddox, R. K. The parallel auditory brainstem response. Trends in Hearing. 23, 2331216519871395 (2019).
- Shi, L., et al. Noise-induced damage to ribbon synapses without permanent threshold shifts in neonatal mice. Neuroscience. 304, 368-377 (2015).
- Lin, H. W., Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the Guinea pig cochlea after reversible noise-induced threshold shift. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (5), 605-616 (2011).
