Summary
På grund av dess mångsidiga tillämpning som modellart inom olika studieområden finns det ett behov av en verktygslåda för genetisk transformation i smalbladig groblad (Plantago lanceolata). Här presenteras med hjälp av Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation ett protokoll som resulterar i stabila transgena linjer med en transformationseffektivitet på 20%.
Abstract
Arter i släktet Plantago har flera unika egenskaper som har lett till att de har anpassats som modellväxter inom olika studier. Bristen på ett genetiskt manipulationssystem förhindrar emellertid en djupgående undersökning av genfunktionen, vilket begränsar mångsidigheten hos detta släkt som modell. Här presenteras ett transformationsprotokoll för Plantago lanceolata, den vanligast studerade Plantago-arten. Med hjälp av Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation, 3 veckor gamla rötter av aseptiskt odlade P. lanceolata växter infekterades med bakterier, inkuberas i 2-3 dagar, och sedan överfördes till ett skott induktion medium med lämpligt antibiotikum urval. Skott kom vanligtvis ut från mediet efter 1 månad, och rötter utvecklades 1-4 veckor efter att skotten överfördes till rotinduktionsmediet. Växterna acklimatiserades sedan till en markmiljö och testades för närvaron av en transgen med hjälp av β-glukuronidas (GUS) reporteranalys. Transformationseffektiviteten för den nuvarande metoden är ~ 20%, med två transgena växter som växer fram per 10 rotvävnader som omvandlas. Upprättandet av ett omvandlingsprotokoll för smalbladiga groblad kommer att underlätta antagandet av denna växt som en ny modellart i olika områden.
Introduction
Konceptet att använda modellarter för att undersöka flera aspekter av växtbiologi uppstod med den utbredda användningen av Arabidopsis thaliana1. Arabidopsis valdes ursprungligen eftersom den delar funktioner med många andra blommande växter och har flera egenskaper som gör det bekvämt att studera i laboratoriemiljö, som att vara liten och ha en kort generationscykel. Den stora volymen forskningsartiklar publicerade med den som ämne, tillsammans med dess lilla genomstorlek och lätthet av genetisk omvandling2, gör det möjligt att fortsätta som en allmänt använd experimentell organism. Arabidopsis kan dock begränsas som modell för arter med olika egenskaper eller unika egenskaper3. Detta har lett till utvecklingen av nya modellsystem, såsom majs (Zea mays), en viktig växt för utvecklingsgenetik i monocots4, och tomat (Solanum lycopersicum), som är en viktig modell för evolutionära studier, fruktutveckling och produktion, och är en bra representation för vegetabiliska grödor5. En metod för genetisk omvandling är en förutsättning för att en växtart ska fungera som modellorganism2. En Agrobacterium tumefaciens-medierad transformation är ett pålitligt verktyg inom växtbiologi; Det har använts för att omvandla några modellarter och större grödor, inklusive tobak (Nicotiana tabacum)6, ris (Oryza sativa)7, bomull (Gossypium hirsutum)8, sojabönor (Glycine max)9, potatis (Solanum tuberosum)10 och raps (Brassica napus)11. Växtarter är mycket varierande i hur framgångsrikt de svarar på A. tumefaciens infektion, och transformationsprotokoll måste ofta skräddarsys individuellt för varje art 6,12.
Släktet Plantago innehåller totalt 256 växtarter, utbredda över hela världen13. Arterna i detta släkte har ofta unika egenskaper som gör dem önskvärda som modellarter för att studera genetik, ekologi, stressfysiologi, sekundära metaboliter, läkemedelskemi, växt-mikrobinteraktioner, växtutveckling och evolution. Plantago lanceolata , även kallad narrowleaf eller ribwort plantain, har varit en populär växt av intresse sedan19-talet , då den först användes för att beskriva fenomenet manlig sterilitet14. Liksom andra växter i sitt släkte har den använts i studier inom olika forskningsområden. På senare tid har det föreslagits som en modell för vaskulär biologi, eftersom dess vaskulära vävnad lätt kan samlasin 15. P. lanceolata är den vanligast studerade arten i släktet Plantago; en artikel från 2021 rapporterade att det fanns >1 400 publikationer inklusive eller relaterade till denna art vid den tiden16, och ytterligare 102 artiklar har publicerats sedan början av 2022, enligt en PubMed-sökning som genomfördes den 9december 2022. Den näst mest studerade växten i släktet, P. major, är föremål för endast 414 artiklar när den söktes med samma kriterier samma datum.
Trots forskningsintresset för P. lanceolata begränsas studier, särskilt om genfunktionskarakterisering, ofta av bristen på en genetisk manipulationsverktygslåda för arten. Pommerrienig et al. gjorde ansträngningar för att utveckla ett transformationsprotokoll för P. major med hjälp av en blommig doppteknik17. Denna metod kan dock inte tillämpas på P. lanceolata på grund av den manliga sterilitetskarakteristiken för denna art18,19. Såvitt vi vet finns det inget befintligt protokoll för omvandling av P. lanceolata.
Denna studie presenterar ett enkelt protokoll för A. tumefaciens-medierad transformation av P. lanceolata. Genom att rikta rotvävnader kan fullvuxna transgena växter genereras inom 3 månader efter omvandling.
Protocol
OBS: Steg 1.4-1.8, 2.3-2.5, 3.3-3.6, 4.1-4.6, 5.1-5.7 och 6.1-6.3 måste utföras under aseptiska förhållanden med en ren huva för att förhindra kontaminering.
1. Förökning av växtmaterial för omvandling
- Placera kommersiellt tillgängliga Plantago lanceolata frön av vildtyp (WT) (se materialtabell) i ett 50 ml centrifugrör upp till 5 ml linjen, beroende på antalet önskade växter.
OBS: Alternativt kan ett 2 ml mikrocentrifugrör användas när ett litet antal frön behövs, men det bör fyllas till en volym som inte är större än 0,1 ml, eftersom för många frön kan minska steriliseringens effektivitet. - Sänk ner fröna i 75% etanol i 60 s.
- Kassera etanolen, sänk sedan ner fröna i 20% natriumhypoklorit (20% NaClO, 80% sterilt vatten) i 40 minuter, vänd försiktigt röret så att alla frön kommer i kontakt med lösningen.
OBS: Natriumhypokloritlösningen måste vara nygjord för optimala resultat. - Kassera natriumhypokloritlösningen under en laminär flödeshuv och tvätta sedan fröna med destillerat vatten (fem gånger). Tillsätt en liten volym vatten till fröna efter den sista sköljningen, eftersom detta kan hjälpa till att hjälpa växterna att röra sig på tallrikar.
- Använd steriliserade pincett, överför fröna till förberedda 95 mm x 100 mm petriskålar med fast MS-medium (tabell 1). Sprid fröna jämnt över plattans yta, med cirka 1 cm mellan varje frö för att förhindra överbeläggning av de grodda plantorna (figur 1A) .
- Förslut plattorna med två lager paraffinfilm för att förhindra kontaminering och inkubera sedan under ett kallt vitt växljus (se materialtabell) vid rumstemperatur (22 °C med 50 μmol m-2 s-1, 12 timmar dagar). Fröna gror vanligtvis inom 5-6 dagar.
- När plantorna har grodd och är tillräckligt stora för att överföra (figur 1B), vanligtvis 2 eller 3 dagar efter groning, använd steriliserade pincett för att överföra plantorna till sterila lådor med 50-100 ml MS-medium (tabell 1). Helst plantera endast fem plantor per låda för att få rötter av bästa kvalitet.
- Försegla lådorna med kirurgisk tejp och låt sedan växterna växa under ett kallt vitt växljus (se materialförteckning), under samma förhållanden som nämns i steg 1.6. Växterna ska vara redo för omvandling på cirka 3-4 veckor, eller när huvudrötterna har vuxit ca 2 cm i längd och sidorötterna verkar vita.
OBS: Medium beredningsrecept och vitaminlager ingår i tabell 1 och tabell 2.
2. Plasmidkonstruktion och E. Coli-transformation
OBS: Den exakta plasmidkonstruktionsproceduren varierar beroende på genen av intresse. I denna procedur användes restriktionsenzymerna HindIII och SalII för att infoga 1,5 kb AtPP2-promotorn i den binära plasmiden pBI101 (se materialförteckning) med GUS, med hjälp av standardkloningsproceduren20. AtPP2 (floemprotein 2) är en gen som uttrycks specifikt i floem21.
- Klona promotorn med primerparen 5'-AGTCAAGCTTCAAGTCCCTGTGGCTGAAC-3' (Forward) och 5'-AGTCGTCGACAAACCAGTATGATGTATTTTTTTTG-3' (Reverse) från Arabidopsis. Figur 2 visar ett diagram över den binära plasmidvektorn med AtPP2: GUS-insatsen.
- Efter plasmidkonstruktion, omvandla plasmiderna till DH5a E. coli (se materialtabell) kompetenta celler med hjälp av värmechockmetod22 och inkubera sedan i 1,5 timmar vid 37 °C med skakning (150 rpm).
- Ta 150 μl av varje omvandlingskultur, platta på LB-agarmediaplattor (tabell 1) med lämpligt urval (50 mg/l kanamycin för den stam som används i detta protokoll, se Materialförteckning) och inkubera sedan plattorna i 16–24 timmar vid 37 °C.
OBS: Den bakteriestam som används i denna studie är A. tumefaciens GV3101. - Använd sedan koloni PCR för att screena kolonierna för positiva rekombinanter23.
OBS: I detta protokoll användes följande primers för att förstärka den riktade genen; 5'-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCAA-3'(framåt) och 5'-TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3' (omvänd).- Kör reaktionen i en termocykler (se materialtabell) med cykelförhållanden på 3 min vid 95 °C, följt av 35 cykler på: 30 s vid 95 °C, 30 s vid 55 °C, 2 min vid 72 °C och ett sista 10 minuters töjningssteg vid 72 °C.
- Inokulera de positiva kolonierna i 6 ml LB-buljong (tabell 1) med lämpligt antibiotikum (50 mg/l kanamycin) och odla vid 37 °C över natten, vid 200-250 rpm.
- Efter tillväxt över natten, extrahera plasmiderna från bakterierna med hjälp av standardprocedurer24.
3. A. tumefaciens transformation med plasmid
- Efter plasmidextraktion, använd elektroporering för att omvandla den modifierade plasmiden till önskad stam av kompetenta celler. I denna procedur användes A. tumefaciens stam GV3101. Följa standardiserade metoder för elektroporeringstekniker25.
- Efter elektroporering suspenderas de kompetenta cellerna på nytt i 1 ml LB-buljong och inkuberas sedan i 2–4 timmar vid 28 °C vid 100 varv/min.
- Samla upp cellerna genom centrifugering vid 6 800 x g i 3 minuter i en bordsmikrocentrifug (se Materialtabell) vid rumstemperatur (22 °C) och sprid sedan 50–100 μl på en LB-agarplatta med ett lämpligt urvalsmedel (50 mg/l kanamycin för den plasmid som används i detta protokoll).
- Efter att cellerna har inkuberat i 2 dagar vid 28 °C, identifiera positiva kolonier som innehåller genen av intresse genom användning av koloni PCR. Använd de primers och förhållanden som nämns i steg 2.4 i detta protokoll.
- Använd sedan de positiva kolonierna för att stryka en lagerplatta med LB-agarmedia + urval. Plattan kan förvaras vid 4 °C i upp till 1 månad.
- Alternativt, för långvarig lagring, inokulera en positiv koloni med en liten volym LB med lämpligt urval. Skaka den inokulerade kulturen över natten vid 28 °C vid 200 rpm och bered sedan en glycerolstam (50 % vikt/volym glycerol i en 50:50 blandning av bakterier och glycerol) som kan förvaras vid -80 °C i upp till 10 år.
4. A. tumefaciens beredning
- Stryk A. tumefaciens innehållande önskad plasmid på beredda 95 mm x 100 mm fasta LB-plattor med lämpligt urvalsmedel. I detta protokoll användes bakteriestammen GV3101 med plasmidinsatsen AtPP2:GUS , med 50 mg/L kanamycin tillsatt för urvalet.
- Förslut plattorna med paraffinfilm och inkubera sedan vid 28 °C i upp till 48 timmar, eller tills bakterierna växer sig stora nog att plocka.
- Använd en pipettspets för att välja en bakteriekoloni 2 dagar före omvandling och inokulera den i ett 15 ml runt bottenrör innehållande 6 ml flytande LB med lämpligt val. Skaka vid 200 varv/min i en 28 °C bordsskakapparat över natten tills OD600 når 0,6-0,7.
OBS: Plattor och 6 ml bakteriell inokulering kan förvaras vid 4 ° C i upp till 1 månad. - När bakterierna når rätt OD600, använd en pipett för att överföra A. tumefaciens till en steril kolv innehållande 100 ml flytande LB med ett selektionsmedel. Vanligtvis är 200 μL bakterier per 100 ml LB lämpliga för förökning. Skaka vid 200 varv/min vid 28 °C över natten tills OD600 når 0,6-0,7.
- Överför bakterierna till 50 ml sterila centrifugrör och centrifugera vid 2 200 xg i 10 minuter vid rumstemperatur (22 °C) i en bordscentrifug för att samla bakterierna.
- Kassera supernatanten med en pipett. Återsuspendera bakteriepelleten i 5 ml rumstemperatur (22 °C) flytande suspensionslösning (SS) (tabell 1) genom pipettering, tillsätt sedan upp till 50 ml SS och vänd upp och ner flera gånger för att blanda. Bakterierna är nu redo för omvandling.
OBS: Vätskan SS måste beredas färskt, inom 1 vecka efter omvandling.
VARNING: Allt material som kommer i kontakt med A. tumefaciens måste kasseras i en biologisk papperskorg. Överblivna vätskor från bakteriekulturer kan steriliseras med natriumhypoklorit (blekmedel) i en koncentration av 20% eller högre.
5. Omvandling av Plantago-rötter
- När växterna når det ideala stadiet för omvandling (plantor är 3 veckor gamla) (Figur 1C), använd sterila pincett och sax för att separera rötterna från resten av växten (Figur 3A). Kassera blad- och stammaterialet.
- Omedelbart efter skärning, överför rotbitarna till sterila lådor som innehåller sterilt vatten med sterila pincett. Detta steg gör att rötterna kan hålla sig hydratiserade medan all vävnad samlas in.
- När alla rötter är skurna, häll A. tumefaciens/SS-suspensionen i sterila 150 mm x 15 mm petriskålar för engångsbruk. Överför rötterna till A. tumefaciens-kulturen och inokulera i minst 20 minuter (figur 3B).
- Under inkubation, använd en steril skalpell med ett skarpt blad för att skära rötterna i 1 cm fragment, separera de primära rötterna från laterala rötterna. Gör tunna, grunda snitt på ytan av rötterna så att bakterierna kan infektera växten.
OBS: Om du hanterar ett stort antal växter, överför rotbitarna till bakteriekulturen i omgångar för att säkerställa att alla rötter är nedsänkta under ympningen. - Efter inkubation, använd de sterila pincetterna för att överföra rotbitarna till sterila pappershanddukar för att avlägsna överskott av bakterier. Undvik att torka rötterna i mer än 60 s, eftersom detta kan orsaka uttorkning och skada rotvävnaden. Helst kan 10-15 rötter torkas samtidigt (figur 3C).
- Överför de torkade rötterna till beredda 95 mm x 15 mm petriskålar med fasta samodlingsmedier (tabell 1), cirka 10-20 rötter per tallrik, beroende på rötternas storlek (figur 3D).
- Försegla plattorna med två lager transparent plastfilm och täck sedan med aluminiumfolie. Inkubera vid rumstemperatur (22 °C) i 3 dagar. Detta steg ger tid för bakterierna att infektera rötterna utan närvaro av ett antibiotiskt urval (figur 3E).
6. Urval och helföryngring av hela växten
- Efter inkubation i samodlingssubstrat, överför rotbitarna till beredda petriskålar på 95 mm x 15 mm med fasta skottinduktionsmedier (SIM) (tabell 1) med Timentin (500 mg/l; se materialförteckning) och lämpligt val av antibiotika. I detta protokoll använde vi kanamycin (100 mg / L).
OBS: Botten av rötterna måste komma i fullständig kontakt med mediet. Rötter som inte vidrör mediets yta är för långa och måste skäras för att förhindra att vävnaden flyr från urvalet. - Försegla plattorna med två lager transparent plastfilm och odla sedan under ett växljus i 1 månad (se steg 1.6 för lämpliga förhållanden), eller tills skotten börjar dyka upp.
OBS: Vanligtvis kan skottinitialer observeras efter 2 veckors tillväxt, och skotten är vanligtvis synliga efter 1 månad. - När plantorna är 1,5-2,0 cm långa (figur 1D), överför dem till förberedda sterila lådor med fast rotinduktionsmedia (tabell 1).
- Odla växterna under ett växljus (se steg 1.6 för förhållanden) i flera veckor tills rötter bildas. Rötter kan vanligtvis ses först efter 1 vecka.
OBS: Det rekommenderas att låta rötterna växa i flera veckor innan de flyttas till jorden, eftersom växter med större rotsystem tenderar att ha en högre överlevnad i jorden.
7. Jordöverföring
- När rotsystemen har blivit tillräckligt stora för att överföra (figur 1E), vanligtvis efter 1 månads tillväxt, överför växterna till 3,5 i fyrkantiga krukor som innehåller förfuktad allroundjord (BM7). I detta protokoll användes BM7 barkblandning (se materialförteckning).
- Ta bort alla medier som fastnar på rötterna genom att tvätta dem försiktigt i vatten.
OBS: Växterna kan odlas till mognad i ett växthus vid 800 till 1400 μmol fotoner m-2 s-2 med 600 W höga natriumtrycklampor (se materialtabell), eller i en tillväxtkammare vid rumstemperatur (22 ° C) med kallt vitt ljus vid 50 μmol m-2 s-1, 12 h dagar.
- Ta bort alla medier som fastnar på rötterna genom att tvätta dem försiktigt i vatten.
- Täck växterna med ett plastkrukskydd och täck dem sedan med en klar plastpåse. Detta steg gör att växterna kan förbli i en fuktig miljö när de anpassar sig till jorden.
- Efter ca 3-5 dagar, ta bort plastpåsen och ta sedan långsamt bort locket för att tillåta acklimatisering till utomhusmiljön.
OBS: Beroende på årstid och miljön som växterna överförs till kan den tid som växterna behöver anpassa sig variera. Kontrollera växterna dagligen och tillsätt vatten till krukorna efter behov rekommenderas. - Vattna växterna regelbundet och tillsätt gödselmedel efter behov. Växter kan också överföras till större krukor för ytterligare tillväxt (figur 1F).
8. β-glukuronidas (GUS) histokemisk färgning
- Bered β-glukuronidas (GUS) färgningslösning enligt publicerade protokoll15.
- När skottinitialerna är cirka 0,5-1 cm långa, ta bort en liten spets av ett ungt, fullt expanderat blad (<5 mm i längd är vanligtvis tillräckligt) och överför omedelbart till 0,5-1 ml GU-färgningslösning i ett 1,5 eller 2 ml mikrocentrifugrör. Lösningen ska helt täcka växtvävnaden.
- Placera de öppnade rören i en vakuumexsickator och dammsug vid 20-25 kPa i 5-10 min. Små bubblor ska vara synliga i lösningen under vakuumproceduren. Detta gör att lösningen kan komma in i växtens celler.
- Låt luft filtrera tillbaka in i vakuumexsickatorn. Stäng rören och inkubera vid 37 °C över natten (12 timmar), eller tills den blå färgen är synlig.
OBS: I denna studie lokaliserades GUS-aktivitet till floemet, vilket innebär att i positivt transformerade växter bör blå färgning endast vara synlig i floemvävnaden. Växter utan transgenen upplever inte färgning (figur 4). - För att bättre visualisera fläcken, överför växterna till 100% etanol för att avlägsna klorofyll. För att öka effektiviteten i klorofyllavlägsnandeprocessen, inkubera rören vid 60 °C i 10 minuter.
OBS: Etanolen kan behöva bytas flera gånger innan all klorofyll avlägsnas, beroende på storleken på bladet som färgas.
Representative Results
Ett enkelt protokoll rapporteras här för att erhålla transgena P. lanceolata växter med användning av A. tumefaciens-medierad transformation. Reportergenen GUS (kodande β-glukuronidas) transformeras, driven av den floemuttryckta promotorn av AtPP2, till 3 veckor gamla P. lanceolata-rötter genom A. tumefaciens stam GV3101 (figur 2). En floemspecifik promotor valdes eftersom vårt huvudsakliga intresse var att etablera ett system för funktionell genomik av växtvaskulära vävnader, särskilt floem. Metoden testades på rot-, blad- och bladvävnaden i det preliminära experimentet. Även om kallus kunde induceras i alla vävnadstyper, producerade endast rotvävnaden skottinitialer (figur 5A) efter 1 månad i SIM; bladet och petiole blev bruna och dog (figur 5B). Detta ledde till slutsatsen att rotvävnad var den optimala vävnadstypen för användning i transformationsmetoden. Rötterna inkuberades i de beredda bakterierna som återsuspenderades i suspensionslösning (SS) (tabell 1) i minst 20 minuter och inkuberades sedan vid rumstemperatur på fasta SS-plattor i upp till 3 dagar i mörker (figur 3E). Rötterna överfördes sedan till skottinduktionsmediet (SIM) och hölls under ett växande ljus under de förhållanden som anges i protokollet (steg 1.6). Figur 1 och figur 3 visar representativa bilder av varje steg i protokollet som referens.
Figur 6 visar utvecklingen av skottinitialer som kommer från transformerad vävnad, från den första dagen rötterna placerades på SIM-kortet (figur 6A) till när skotten var redo att rotas (figur 6D). Efter 1 vecka bildade rotvävnaden kallus (figur 6B), och början av skottinitialer kunde observeras (figur 6B1). Skott fortsatte att dyka upp under vecka 2 och 3 (figur 6C), och efter 4 veckor var skotten redo att överföras till rotinduktionsmediet (figur 6D).
Identifiering av de förmodade transgena växterna utfördes med hjälp av β-glukuronidas (GUS) histokemiska analys, med hjälp av bladsegment som togs när skotten var cirka 0,5 cm långa. Positiva transgena växter visade det förväntade färgningsmönstret i floemlokaliserad vävnad, vilket visas i figur 4. Positiva GUS-färgade skott överfördes till rotinduktionsmediet, där de utvecklade robusta rotsystem efter 4 veckor (figur 1E). Rotade växter överfördes sedan till jorden. Figur 4 visar resultatet av färgning i en smalbladig groblad transformerad med AtPP2-promotorn och β-glukuronidas (GUS) -genen, tillsammans med en vildtyp och en smalbladig groblad transformerad med AtPP2-promotorn , för jämförelse. Alla skott som uppstod bekräftades som transgena. Transformationseffektiviteten bestämdes till i genomsnitt 20%, med ungefär två skott som uppstod för varje 10 rötter som förvandlades. Bekräftade transgena växter överfördes till större krukor och odlades i 4-8 veckor tills de nådde vuxenstadiet (figur 1F).
Figur 1: Tidslinje för Plantago lanceolata transformation. Representativa bilder av varje steg i protokollet. a) Ogrodda frön pläterade på en MS-platta. (B) Frön som groddar efter 1 vecka, färdiga att överföras till magentaboxar. (C) Växter i MS-lådor efter 3 veckors tillväxt. Rötter är gröna och friska, i det perfekta skedet för omvandling. (D) Skott i skottinduktionsmedia efter 4 veckor är redo att överföras till rotmediet. I detta skede kan β-glukuronidas (GUS) histokemisk färgning utföras, om tillämpligt. (E) Växter i lådor med rotinduktionsmedium, där rötter har bildats efter 4 veckors tillväxt. (F) Transgena växter odlas till full längd efter 4 veckors tillväxt i jord. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Diagram över den binära vektorplasmiden pBI101 + β-glukuronidas (GUS) med den infogade floemspecifika promotorn AtPP2. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Omvandlingssteg. Representativa bilder av varje omvandlingssteg. (A) Separera rötter från skott under omvandling. (B) Blötläggning av rötter i bakterier / SS-suspension. (C) Torka rötter på pappershanddukar för att avlägsna överflödiga bakterier. (D) Rötter pläterade på samkulturmedium. (E) SS-plattor inslagna i aluminiumfolie. Växter inkuberades i 2-3 dagar innan de överfördes till skjutmediet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: GUS-färgning . β-glukuronidas (GUS) färgningsresultat av smalbladiga grobladsegment. (A) Vild typ. (B) Smalbladig groblad transformerad med plasmiden som hyser AtPP2-promotorn (tom vektor). (C) Smalbladig groblad transformerad med plasmiden som innehåller AtPP2-promotorn och β-glukuronidas (GUS) -genen. Varje blad färgades med hjälp av GUS histokemiska färgningsprotokoll och avbildades sedan med en mikroskopisk kamera. Bilderna (B) och (C) visar inget färgningsmönster på grund av frånvaron av GUS-genen. Den högra bilden visar ett klarblått färgningsmönster i venerna, vilket bekräftar att växterna är transgena. Stången representerar 1 mm, med varje bladsegment som mäter cirka 1 cm i längd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Jämförelse av omvandlingseffektivitet för olika vävnadstyper efter inkubation på >1 månad på skjutmedier . (A) Rotvävnad efter mer än 1 månads tillväxt. Rötter har upplevt expanderad kallus och skjutinitialer har dykt upp. Icke-transformerad kallus har börjat dö som svar på antibiotikaval. (B) Blad- och petiolvävnader efter mer än 1 månads tillväxt. Vävnader upplevde viss kallusexpansion men dog snart som svar på antibiotikumet. Inga skott kom ut från någon av vävnaderna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Uppkomst av kallus och skott på transformerad vävnad. Representativa bilder av vävnader placerade på tagningsmedium efter olika inkubationslängder. (A) Rotvävnader strax efter att ha pläterats på fotograferingsmediet. (B) Rotvävnad efter 1 vecka på fotograferingsmedium. Kallusexpansion kan observeras, och (B1) de första skottinitialerna har börjat dyka upp. (C) Rotvävnad efter 3 veckor på fotograferingsmedium. Fler skjutinitialer har dykt upp. (C1) Skottet som kom fram från B1-fotograferingen initialt. d) Rotvävnad efter 4 veckors inkubation. Icke-transformerad vävnad har börjat bli svart/brun och dö, och nya skott fortsätter att växa. I detta skede är skott redo att flyttas till rotmediet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Recept för medieberedning. En beskrivning av hur man förbereder medier för transformation. Mängden tillsatta vitaminer beräknas utifrån den angivna stamlösningens koncentration. Se tabell 2 för beredning av stamlösning av vitamin. För alla medier, tillsätt reagens till 900 ml dubbeldestilleratH2O, pH till angiven nivå och tillsätt sedan vatten till en slutlig volym på 1 000 ml. * = tillsätt efter sterilisering. ** = pH med 1 M KOH. = pH med 1 M NaOH. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Vitaminlager för Plantago-medier . Alla vitaminer måste filtreras steriliseras och märkas noggrant före förvaring. Lös pulvret först i 1 N NaOH där så anges, fyll sedan på önskad volym med dubbeldestilleratH2O. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
Avsaknaden av ett transformationsprotokoll för växter i släktet Plantago begränsar användningen av dessa växter som modeller, särskilt när forskare är intresserade av att utforska genfunktioner. P. lanceolata valdes för att utveckla ett genetiskt transformationsprotokoll eftersom det är den mest studerade växten i sitt släkte16. Protokollet som har utvecklats kommer sannolikt att användas som ett verktyg för att ytterligare främja studier relaterade till vaskulärbiologi, ekologi, växt-insektsinteraktioner och abiotisk stressfysiologi.
Protokollet som presenteras beskriver tydligt steg som gör det möjligt för en användare att få transgena växter. Förutom P. lanceolatas förmåga att trivas i en vävnadsodlingsmiljö bidrog flera faktorer till framgången för vår transformationsmetod. Först observerades vikten av att använda högkvalitativ, steril växtrotvävnad för transformation. Rötter hade de högsta omvandlingshastigheterna när de togs från 3-4 veckor gamla växter och verkade gröna eller blekvita. Rötter som togs från lådor med någon mängd bakteriell eller svampförorening resulterade ofta i förorenade skottkulturer, och äldre rötter som verkade bruna resulterade inte i framgångsrik omvandling. Rotvävnad var den mest effektiva vävnadstypen för transformation med den nuvarande metoden, eftersom blad- och bladvävnad misslyckades med att utveckla skott.
En annan viktig observation var att den optimala metoden för att samla rotvävnad för omvandling var att placera nyklippt rotmaterial i sterilt vatten. Detta steg tillät effektivt rotmaterial att förbli hydratiserat medan resten av vävnaden samlades in, eftersom rötter tenderar att torka ut snabbt när de tas bort från sina tillväxtbehållare. Detta steg bidrog också till att öka framgångsgraden för omvandlingen, eftersom det tillät fler rötter att inkuberas i bakterierna samtidigt.
Detta protokoll kan modifieras genom att minska tiden som rotvävnaden inkuberar i samodlingsmediet till 2 dagar. Det observerades att en 2 eller 3 dagars inkubationsperiod är tillräcklig för att tillåta infektion som resulterar i skottinitialer. Längre inkubationstider rekommenderas dock inte, eftersom det observerades att frånvaron av en antibiotikahämmare i media ofta resulterar i överväxt av A. tumefaciens , vilket kan döda den framväxande vävnaden.
En begränsning av denna studie är bristen på tillgängliga data om prestanda för andra metoder eller arter av A. tumefaciens i P. lanceolata transformation för jämförelse. Såvitt vi vet är detta protokoll nytt. Under de första försöken noterades en hög omvandlingseffektivitet med A. tumefaciens GV3101, och vi fokuserade på att förfina tekniken med hjälp av denna stam istället för att experimentera med andra stammar. Vår omvandlingseffektivitet på 20% är relativt hög för växtomvandling - många konventionella metoder anser att allt >1% är framgångsrikt26,27,28. Att använda en annan stam av A. tumefaciens, såsom A. rhizogenes, känd för sin användning i rottransformation hos flera arter 29,30,31, kan dock resultera i en ännu högre framgångsgrad. Ytterligare experiment skulle behövas för att bedöma effekterna av att använda andra stammar för att främja ökad omvandlingseffektivitet i P. lanceolata.
Den framgångsrika omvandlingen av P. lanceolata kommer sannolikt att gynna många studier. Den höga omvandlingseffektiviteten och den snabba tillväxten av växten i vävnadsodlingsmedier gör P. lanceolata till en genomförbar kandidat för genfunktionsstudier15.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation (EDGE IOS-1923557 till C.Z. och Y.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34 | ThermoFisher Scientific | 150268 | |
| 1-Naphthylacetic acid | Gold Biotechnology | N-780 | |
| 3M Micropore Surgical Paper Tape | ThermoFisher Scientific | 19-027761 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Research Products International Corp. | 163227LC | |
| 600 Watt High Pressure Sodium Lights | Plantmax | PX-LU600 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BAP) | Gold Biotechnology | B-110 | |
| Aluminum Foil | ThermoFisher Scientific | 01-213-100 | |
| Bacto Agar | Thermofisher Scientific | 214010 | |
| Binary Plasmid pBI101 | Clontech, USA | 632522 | |
| Cool White Grow Light Sylvania LLC | Home Depot | 315952205 | |
| D-biotin | ThermoFisher Scientific | BP232-1 | |
| ddH2O | |||
| DH5a E. coli | Invitrogen, USA | 18258012 | |
| Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm | ThermoFisher Scientific | FB0875714G | |
| Dissecting Scissors | Leica Biosystems | 38DI12044 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705 | |
| Folic Acid | Fisher Scientific | BP2519-5 | |
| Forceps | Leica Biosystems | 38DI18031 | |
| Gelrite | Research Products International Corp. | G35020-1000 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | 17904 | |
| Glycine | Sigma | 241261 | |
| Incubated Tabletop Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | SHKE420HP | |
| Indole-3-Acetic Acid (IAA) | Gold Biotechnology | I-110 | |
| Indole-3-Butyric Acid (IBA) | Gold Biotechnology | I-180 | |
| Kanamycin Monosulfate | Gold Biotechnology | K-120 | |
| Macrocentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Magenta Boxes | ThermoFisher Scientific | 50255176 | |
| Micro Pipet Tips 1000 µL | Corning | 4140 | |
| Micro Pipet Tips 200 µL | Corning | 4138 | |
| Micro Pipette Tips 10 µL | Corning | 4135 | |
| Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002410 | |
| Micropipettor 0.5-10 µL | Corning | 4071 | |
| Micropipettor 100-1000 µL | Corning | 4075 | |
| Micropipettor 20-200 µL | Corning | 4074 | |
| Micropipettor 2-20 µL | Corning | 4072 | |
| Murashige & Skooge Basal Medium with Vitamins | PhytoTech | M519 | |
| Murashige & Skooge Basal Salt Mixture | PhytoTech | M524 | |
| myo-Inositol | Gold Biotechnology | I-25 | |
| Nicotinic acid | Sigma | N0761-100g | |
| Parafilm (paraffin film) | ThermoFisher Scientific | S37440 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Research Products International Corp. | P44000 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P6280-10g | |
| Scalpel Blade Handle | Leica Biosystems | 38DI36419 | |
| Scalpel Blades | Leica Biosystems | 3802181 | |
| Sodium Chloride, Crystal (NaCl) | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Research Products International Corp. | S24000 | |
| Sodium Hypochlorite | Walmart | 23263068401 | |
| Soil- Bark Mix | Berger, USA | BM7 | |
| Square Pots (3.5 inches squared) | Greenhouse Megastore | CN-TRK-1835 | |
| Sucrose | Research Products International Corp. | S24060 | |
| Thermocycler | ThermoFisher Scientific | A24811 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T4625-5G | |
| Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin) | Gold Biotechnology | T-104 | |
| trans-Zeatin Riboside (ZR) | Gold Biotechnology | Z-100 | |
| Tryptone | Thermofisher Scientific | 211705 | |
| Wild Type Plantago lanceolata seeds | Outsidepride Seed Source, OR, USA | F1296 | Outsidepride.com |
| Yeast Extract Granulated | Research Products International Corp. | Y20025-1000 |
References
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. The Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Bragg, J. N., Anderton, A., Nieu, R., Vogel, J. P. Brachypodium distachyon. Agrobacterium Protocols. , Springer. New York, NY. 17-33 (2015).
- Chang, C., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Field guide to plant model systems. Cell. 167 (2), 325-339 (2016).
- Müller, B., Grossniklaus, U.
- Ding, X., et al. Different fruit-specific promoters drive AtMYB12 expression to improve phenylpropanoid accumulation in tomato. Molecules. 27 (1), 317 (2022).
- Niedbała, G., Niazian, M., Sabbatini, P. Modeling agrobacterium-mediated gene transformation of tobacco (Nicotiana tabacum)-a model plant for gene transformation studies. Frontiers in Plant Science. 12, 695110 (2021).
- Kumari, D., Prasad, B., Dwivedi, P. Genome Editing Platforms in Rice (Oryza sativa L.): Basic methodology and troubleshooting. , (2022).
- Zhang, B. Agrobacterium-mediated transformation of cotton. Transgenic Cotton. , Humana Press. Totowa, NJ. 31-45 (2013).
- Tiwari, R., Singh, A. K., Rajam, M. V. Improved and reliable plant regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation in soybean (Glycine max L). Journal of Crop Science and Biotechnology. , 1-10 (2022).
- Bakhsh, A. Development of efficient, reproducible and stable Agrobacterium-mediated genetic transformation of five potato cultivars. Food Technology and Biotechnology. 58 (1), 57-63 (2020).
- Bates, R., Craze, M., Wallington, E. J. Agrobacterium-mediated transformation of oilseed rape (Brassica napus). Current Protocols in Plant Biology. 2 (4), 287-298 (2017).
- Hopp, H. E., Spangenberg, G., Herrera-Estrella, L.
- Abdelmuhsin, A. A., Alghamdi, A. A., Ibrahim, N. A. Assessing the phenotypic and genotypic variations of Plantago ciliata in Ha'il region, Saudi Arabia. Entomology and Applied Science Letters. (1), 14-22 (2021).
- Coleman, N.
- Huang, J., et al. Tissue-specific transcriptomic profiling of Plantago major provides insights for the involvement of vasculature in phosphate deficiency responses. Molecular Genetics and Genomics. 294 (1), 159-175 (2019).
- Penczykowski, R. M., Sieg, R. D. Plantago spp. as models for studying the ecology and evolution of species interactions across environmental gradients. The American Naturalist. 198 (1), 158-176 (2021).
- Pommerrenig, B., et al. Common plantain. A collection of expressed sequence tags from vascular tissue and a simple and efficient transformation method. Plant Physiology. 142 (4), 1427-1441 (2006).
- Bergero, R., Levsen, N., Wolff, K., Charlesworth, D. Arms races with mitochondrial genome soft sweeps in a gynodioecious plant, Plantago lanceolata. Molecular Ecology. 28 (11), 2772-2785 (2019).
- Aalto, E. A., Koelewijn, H. P., Savolainen, O. Cytoplasmic male sterility contributes to hybrid incompatibility between subspecies of Arabidopsis lyrata. G3: Genes, Genomes, Genetics. 3 (10), 1727-1740 (2013).
- Bloch, K. D., Grossmann, B. Digestion of DNA with restriction endonucleases. Current Protocols in Molecular Biology. 3 (1), (1995).
- Du, C., et al. Prokaryotic expression, purification, physicochemical properties and antifungal activity analysis of phloem protein PP2-A1 from cucumber. International Journal of Biological Macromolecules. 194, 395-401 (2022).
- Deshmukh, S. 22, Kulkarni, R., Bose, K. Transformation and protein expression. Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant Proteins. , Springer. Singapore. 83-114 (2022).
- Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, Academic Press. 299-309 (2013).
- Broehan, G., Kroeger, T., Lorenzen, M., Merzendorfer, H. Functional analysis of the ATP-binding cassette (ABC) transporter gene family of Tribolium castaneum. BMC Genomics. 14, 6 (2013).
- Dong, Z., et al. Stable transformation of fluorescent proteins into Nosema bombycis by electroporation. Parasites & Vectors. 15 (1), 141 (2022).
- Li, S., et al.
- Manimaran, P., et al. Infection of early and young callus tissues of indica rice BPT 5204 enhances regeneration and transformation efficiency. Rice Science. 20 (6), 415-426 (2013).
- Wang, J., Nie, J., Pattanaik, S., Yuan, L. Efficient Agrobacterium-mediated transformation of Artemisia annua L. using young inflorescence. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 52 (2), 204-211 (2016).
- Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in soybean. Plants. 11 (8), 1044 (2022).
- Geng, S., et al. An efficient root transformation system for CRISPR/Cas9-based analyses of shoot-root communication in cucurbit crops. Horticulture Research. 9, (2022).
- Xiao, Y., et al. Efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation using cotyledons, hypocotyls and roots of 'Duli'(Pyrus betulifolia Bunge). Scientia Horticulturae. 296, 110906 (2022).
