使用基本显微镜和智能手机可视化大麦（大麦）稻瘟病（稻瘟病）的早期感染部位
Summary
这是使用最少的试剂和常用实验室设备（包括基本的智能手机）进行大麦叶鞘测定的简单方案。目的是在没有先进显微镜设备的实验室中可视化原始疾病的早期感染过程。
Abstract
了解植物和病原体如何相互作用，以及这种相互作用是否最终导致防御或疾病，需要制定更强大，更可持续的植物健康策略。在感染和定植期间更有效地对植物病原体样品进行成像的方法的进步已经产生了诸如水稻叶鞘测定之类的工具，该测定可用于监测水稻与真菌病原体 Magnaporthe oryzae之间的感染和早期定植事件。这种半生物营养病原体导致水稻和相关单子叶植物（包括小米、黑麦、大麦以及最近的小麦）的严重疾病损失。如果正确执行叶鞘测定，会产生光学透明的植物切片，几层厚，这使得研究人员能够在病原体攻击期间进行活细胞成像或生成针对特定特征染色的固定样品。对大麦-米曲霉 相互作用的详细细胞研究落后于水稻宿主，尽管这种谷物作为动物和人类的食物来源以及发酵饮料的重要性日益增加。这里报道的是大麦叶鞘测定法的发展，用于接种后前48小时内米 曲霉 相互作用的复杂研究。无论正在研究哪种物种，叶鞘测定都是微妙的;提供的协议涵盖了从大麦生长条件和获得叶鞘到植物叶片上病原体的接种、孵育和成像的所有内容。该协议可以针对高通量筛选进行优化，使用智能手机等简单的东西进行成像。
Introduction
稻瘟病真菌可感染各种谷物作物，包括大麦、小麦和水稻1。这种病原体会导致毁灭性的疾病，并对这些有价值的作物构成世界性的威胁，如果不加以控制，会导致作物完全损失。世界各地的许多实验室都关注稻瘟病，因为它具有全球威胁，并且是植物-真菌相互作用的优秀模型2。它已被完全测序，其感染周期的遗传学，特别是早期事件，已经确定3，4。生命周期从孢子在叶子表面萌发开始，形成称为顶膜的特殊渗透结构。蝾螈穿透叶片组织，感染继续发展病变，开始孢子形成过程并传播疾病4。预防这些早期事件中的任何一个都将极大地抑制这种毁灭性的疾病。因此，目前大多数关于原始细胞病的研究都集中在早期感染步骤上，从形成压迫层的发芽分生孢子到侵袭性菌丝和生物营养界面复合物（BIC）的发展5。
尽管 米曲霉 菌是多种作物的重要病原体，但对稻瘟病害进行了大量研究，新进化的菌株正在成为小麦的全球威胁6。虽然水稻是用于养活人口的三大主食作物之一，与小麦和玉米一起，但就牲畜饲料和啤酒生产而言，大麦是第四大谷物7。随着精酿啤酒行业的发展，大麦的经济价值也在增长。使用 米曲霉菌 和大麦作为病理系统来研究原始细胞病有明显的优势。首先，有些米 分枝杆菌 菌株只能感染大麦，也有可以感染多种草的菌株。例如，4091-5-8主要只感染大麦，而Guy11和70-15可以感染大麦和大米8。这些菌株在基因上相似，感染过程相当9。其次，在标准的实验室和温室条件下，大麦更容易种植，因为它没有水稻的复杂要求（简洁的温度控制，高湿度，特定的光谱）。由于叶子表面的疏水性，水稻也存在成像挑战，大麦没有表现出10。
该协议提供了一种简单的方法，用于分离和有效利用大麦叶鞘进行多个感染阶段的显微镜分析，使用常见的实验室用品和智能手机进行数据收集。这种用于大麦叶鞘测定的方法适用于世界各地的实验室，因为它需要最少的供应，但提供了病原体与其感染的前几个细胞之间微观相互作用的清晰图像。虽然致病性测定（例如喷雾或飞沫接种）可以提供病原体形成病变能力的宏观视图，但该测定允许研究人员可视化早期感染的特定步骤，从渗透前事件到表皮细胞定植。此外，研究人员可以很容易地将野生型真菌的感染与毒力降低的突变体的感染进行比较。
Protocol
Representative Results
Discussion
有许多常用的检测方法可用于检测 米曲霉 菌株，这些菌株可提供相容或不相容感染反应的宏观水平视觉，例如喷雾或飞沫接种，以及使用评级系统来量化病变大小13，14。 米粒分枝杆菌 的另一种常见测定是测试病原体形成其特殊渗透结构的能力，即apppressorium 15。这里描述的是一种简单的方法，用于在细胞水平上快速有?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者承认来自USDA-NIFA奖2016-67013-24816的资金。
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
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