オオムギのイネいもち病(Magnaporthe oryzae)の初期感染部位を基礎顕微鏡とスマートフォンで可視化
Summary
これは、最小限の試薬と一般的な実験装置(基本的なスマートフォンを含む)を使用した大麦葉鞘アッセイの簡単なプロトコルです。目的は、高度な顕微鏡装置にアクセスすることなく、実験室でいもち病の初期感染プロセスを視覚化することです。
Abstract
植物と病原体がどのように相互作用するか、そしてその相互作用が防御または病気で最高潮に達するかどうかを理解することは、植物の健康のためのより強力でより持続可能な戦略を開発するために必要です。感染およびコロニー形成中に植物病原体サンプルをより効果的にイメージングする方法の進歩により、イネ葉鞘アッセイなどのツールが得られ、イネと真菌病原体である Magnaporthe oryzaeとの間の感染および早期コロニー形成イベントのモニタリングに役立ちました。この半生物栄養病原体は、イネおよびキビ、ライ麦、大麦、そして最近では小麦を含む関連する単子葉植物に深刻な病気の喪失を引き起こします。葉鞘アッセイは、正しく実行されると、数層の厚さの光学的に透明な植物切片が得られるため、病原体の攻撃中に生細胞イメージングを実行したり、特定の特徴について染色された固定サンプルを生成したりできます。オオムギM.の詳細な細胞調査。 麹の相互作用は、動物や人間の食料源として、また発酵飲料としてのこの穀物の重要性が高まっているにもかかわらず、イネの宿主の相互作用に遅れをとっています。 ここで報告されているのは、接種後最初の48時間における M. oryzae 相互作用の複雑な研究のための大麦葉鞘アッセイの開発です。葉鞘アッセイは、どの種が研究されているかに関係なく、繊細です。オオムギの成長条件や葉鞘の取得から、植物の葉への病原体の接種、インキュベーション、イメージングまで、すべてをカバーするプロトコルが提供されます。このプロトコルは、イメージング目的でスマートフォンのようなシンプルなものを使用して、ハイスループットスクリーニング用に最適化できます。
Introduction
イネいもち病菌であるマグナポルテ・オリゼは、大麦、小麦、米などのさまざまな穀物に感染します1。この病原体は壊滅的な病気を引き起こし、これらの貴重な作物に世界的な脅威をもたらし、制御しないと完全な作物の損失を引き起こします。世界中の多くの研究所は、その世界的な脅威と植物と真菌の相互作用の優れたモデルとしての属性のために、イネいもち病に焦点を当てています2。それは完全に配列決定されており、その感染サイクルの遺伝学、特に初期のイベントが確立されています3,4。ライフサイクルは、葉の表面に胞子が発芽することから始まり、付着器と呼ばれる特殊な貫通構造を形成します。付着器は葉の組織を貫通し、感染は胞子形成のプロセスを開始し、病気を広げる病変の発生とともに続きます4。これらの初期の出来事のいずれかを防ぐことは、この壊滅的な病気を劇的に抑制するでしょう。その結果、いもち病に関する最新の研究のほとんどは、付着器を形成する発芽分生子から侵襲性菌糸および生物栄養界面複合体(BIC)の開発まで、初期の感染ステップに焦点を合わせています5。
いもち病に関する膨大な量の研究はイネで行われてきましたが、 M. oryzae はさまざまな作物にとって重要な病原体であり、新たに進化した株が小麦に対する世界的な脅威として浮上しています6。米は小麦やトウモロコシと並んで人口を養うために使用される上位3つの主食作物の1つですが、大麦は家畜飼料とビール生産の点で4番目の穀物です7。クラフトビール産業が成長するにつれて、大麦の経済的価値も高まります。 M. oryzae と大麦をいもち病を研究するための病理システムとして使用することには明確な利点があります。第一に、オオムギだけに感染する M. oryzae の株と、複数の草種に感染することができる株があります。たとえば、4091-5-8は主に大麦のみに感染しますが、Guy11と70-15は主に大麦と米の両方に感染する可能性があります8。これらの株は遺伝的に類似しており、感染プロセスは同等です9。第二に、標準的な実験室および温室条件下では、大麦は米の複雑な要件(簡潔な温度制御、高湿度、比光スペクトル)がないため、栽培が容易です。また、葉の表面が疎水性であるため、イネにはイメージングの課題があり、大麦は10を示しません。
このプロトコルは、一般的な実験用品とデータ収集用のスマートフォンを使用して、複数の感染段階の顕微鏡分析のために大麦葉鞘を分離し、効果的に利用するための簡単な方法を提示します。大麦葉鞘アッセイのこの方法は、最小限の供給で済み、病原体とそれが感染する最初の数細胞との間の微視的相互作用の明確な画像を提供するため、世界中のラボに適応できます。スプレーや液滴接種などの病原性アッセイは、病原体が病変を形成する能力のマクロビューを提供できますが、このアッセイにより、研究者は、浸透前のイベントから表皮細胞のコロニー形成まで、早期感染の特定のステップを視覚化できます。さらに、研究者は、野生型真菌による感染を、病原性が低下した変異体による感染と容易に比較することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
M. oryzae株を試験するために利用できる多くの一般的に使用されるアッセイがあり、スプレーまたは飛沫接種などの適合性または不適合の感染反応の巨視的レベルの視覚を提供し、病変サイズを定量化するための評価システムの使用13,14。M. oryzaeの別の一般的なアッセイは、病原体がその特殊な浸透構造であるapppressorium15を形成する能力…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、USDA-NIFA賞2016-67013-24816からの資金提供を認めています。
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
Riferimenti
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
