기본 현미경과 스마트폰을 사용하여 보리(Hordeum vulgare)에 벼 돌풍병(Magnaporthe oryzae)의 초기 감염 부위 시각화
Summary
이것은 최소한의 시약과 일반적인 실험실 장비(기본 스마트폰 포함)를 사용하는 보리 잎 덮개 분석의 간단한 프로토콜입니다. 그 목적은 첨단 현미경 장비를 사용하지 않고 실험실에서 모세포 질환의 초기 감염 과정을 시각화하는 것입니다.
Abstract
식물과 병원체가 어떻게 상호 작용하는지, 그리고 그 상호 작용이 방어 또는 질병으로 절정에 달하는지 여부를 이해하는 것은 식물 건강을 위한 더 강력하고 지속 가능한 전략을 개발하는 데 필요합니다. 감염 및 집락화 동안 식물 병원체 샘플을 보다 효과적으로 이미지화하는 방법의 발전으로 벼와 곰팡이 병원체인 Magnaporthe oryzae 사이의 감염 및 초기 집락화 사건을 모니터링하는 데 유용한 벼잎 덮개 분석과 같은 도구가 생성되었습니다. 이 반생물영양 병원체는 벼와 기장, 호밀, 보리, 그리고 최근에는 밀을 포함한 관련 외떡잎식물에서 심각한 질병 손실을 유발합니다. 잎집 분석을 올바르게 수행하면 여러 층 두께의 광학적으로 투명한 식물 섹션을 생성하여 연구자가 병원균 공격 중에 생세포 이미징을 수행하거나 특정 기능에 대해 염색된 고정 샘플을 생성할 수 있습니다. 보리-M에 대한 상세한 세포 조사. oryzae 상호 작용은 동물과 인간의 식량 공급원이자 발효 음료로서 이 곡물의 중요성이 커지고 있음에도 불구하고 벼 숙주의 상호 작용에 뒤쳐져 있습니다. 여기에 보고된 것은 접종 후 처음 48시간 동안 M. oryzae 상호 작용에 대한 복잡한 연구를 위한 보리 잎 덮개 분석의 개발입니다. 잎집 분석은 어떤 종을 연구하든 섬세합니다. 보리 성장 조건 및 잎집 획득부터 식물 잎에 대한 병원체의 접종, 배양 및 이미징에 이르기까지 모든 것을 포괄하는 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 이미징 목적으로 스마트폰과 같은 간단한 것을 사용하여 고처리량 스크리닝에 최적화할 수 있습니다.
Introduction
벼 도풍균인 Magnaporthe oryzae는 보리, 밀, 쌀을 포함한 다양한 곡물 작물을 감염시킨다1. 이 병원체는 치명적인 질병을 일으키고 이러한 귀중한 작물에 전 세계적으로 위협이 되어 통제하지 않으면 완전한 작물 손실을 초래합니다. 전 세계의 많은 실험실에서 벼 도열병에 초점을 맞추고 있는데, 그 이유는 벼 도열병의 전 세계적인 위협과 식물-곰팡이 상호작용을 위한 훌륭한 모델로서의 특성 때문입니다2. 그것은 완전히 시퀀싱되었으며, 감염주기의 유전학, 특히 초기 사건이 확립되었습니다 3,4. 수명주기는 잎 표면에서 발아하는 포자로 시작하여 appressorium이라는 특수 침투 구조를 형성합니다. 감염은 잎 조직을 관통하며, 포자 형성 과정을 시작하고 질병을 퍼뜨리는 병변의 발달과 함께 감염이 계속된다4. 이러한 초기 사건을 예방하면 이 파괴적인 질병을 크게 억제할 수 있습니다. 결과적으로, 돌풍병에 대한 대부분의 현재 연구는 발아된 분생포자가 appressorium을 형성하는 것부터 침습성 균사 및 생물영양 계면 복합체(BIC)의 발달에 이르기까지 초기 감염 단계에 초점을 맞추고 있습니다.5.
M. oryzae는 다양한 작물의 중요한 병원체이며, 새로 진화한 균주가 밀에 대한 세계적인 위협으로 부상하고 있음에도 불구하고 벼에서 돌풍병에 대한 방대한 연구가 수행되었습니다6. 쌀은 밀, 옥수수와 함께 인구를 먹여 살리는 데 사용되는 상위 3대 주요 작물 중 하나이지만, 보리는 가축 사료 및 맥주 생산 측면에서 네 번째 곡물입니다7. 크래프트 맥주 산업이 성장함에 따라 보리의 경제적 가치도 커집니다. M. oryzae와 보리를 돌풍병을 연구하기 위한 병리학 시스템으로 사용하는 데에는 뚜렷한 이점이 있습니다. 첫째, 보리만 감염시키는 M. oryzae 균주와 여러 풀 종을 감염시킬 수 있는 균주가 있습니다. 예를 들어, 4091-5-8은 주로 보리만 감염시키는 반면, Guy11과 70-15는 보리와 쌀8을 모두 감염시킬 수 있다. 이 균주는 유전적으로 유사하며 감염 과정은 비슷합니다9. 둘째, 표준 실험실 및 온실 조건에서 보리는 쌀의 복잡한 요구 사항(간결한 온도 제어, 고습도, 특정 광 스펙트럼)이 없기 때문에 재배가 더 쉽습니다. 또한 보리가 나타내지 않는 잎 표면의 소수성으로 인해 쌀에 대한 이미징 문제가 있습니다10.
이 프로토콜은 데이터 수집을 위해 일반적인 실험실 용품과 스마트폰을 사용하여 여러 감염 단계의 현미경 분석을 위해 보리 잎집을 분리하고 효과적으로 활용하는 간단한 방법을 제시합니다. 보리 잎 덮개 분석을 위한 이 방법은 최소한의 공급이 필요하기 때문에 전 세계 실험실에 적용할 수 있지만 병원체와 병원체가 감염시키는 처음 몇 개의 세포 사이의 미세한 상호 작용에 대한 명확한 그림을 제공합니다. 스프레이 또는 액적 접종과 같은 병원성 분석은 병원체의 병변 형성 능력에 대한 거시적 관점을 제공할 수 있는 반면, 이 분석을 통해 연구원은 사전 침투 사건에서 표피 세포의 집락화에 이르기까지 초기 감염의 특정 단계를 시각화할 수 있습니다. 또한 연구자들은 야생형 곰팡이 감염과 독성이 감소된 돌연변이 감염을 쉽게 비교할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
스프레이 또는 비말 접종과 같은 양립하거나 양립할 수 없는 감염 반응에 대한 거시적 수준의 시각을 제공하고 병변 크기를 정량화하기 위한 등급 시스템을 사용하는 M. oryzae 균주를 테스트하는 데 일반적으로 사용되는 분석법이 많이 있습니다. M. oryzae에 대한 또 다른 일반적인 분석은 병원체가 특수 침투 구조인 압프레소리움(apppressorium)?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 USDA-NIFA 상 2016-67013-24816의 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
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