Detta är ett enkelt protokoll för en kornbladmantelanalys med minimala reagens och vanlig laboratorieutrustning (inklusive en grundläggande smartphone). Syftet är att visualisera den tidiga infektionsprocessen av blastsjukdom i laboratorier utan tillgång till avancerad mikroskopiutrustning.
Att förstå hur växter och patogener interagerar, och om den interaktionen kulminerar i försvar eller sjukdom, krävs för att utveckla starkare och mer hållbara strategier för växtskydd. Framsteg inom metoder som mer effektivt avbildar växtpatogenprover under infektion och kolonisering har gett verktyg som risbladsmantelanalysen, som har varit användbar vid övervakning av infektion och tidiga koloniseringshändelser mellan ris och svamppatogenen, Magnaporthe oryzae. Denna hemi-biotrofa patogen orsakar allvarlig sjukdomsförlust i ris och relaterade monocots, inklusive hirs, råg, korn och nyligen vete. Bladmantelanalysen, när den utförs korrekt, ger en optiskt klar växtsektion, flera lager tjock, vilket gör det möjligt för forskare att utföra levande cellavbildning under patogenattack eller generera fasta prover färgade för specifika egenskaper. Detaljerade cellulära undersökningar av korn-M. oryzae-interaktionen har släpat efter risvärdens, trots den växande betydelsen av detta spannmål som livsmedelskälla för djur och människor och som fermenterade drycker. Här rapporteras utvecklingen av en analys av kornbladsmantel för invecklade studier av M. oryzae-interaktioner under de första 48 timmarna efter inokuleringen. Bladmantelanalysen, oavsett vilken art som studeras, är känslig; Förutsatt är ett protokoll som täcker allt, från korntillväxtförhållanden och erhållande av en bladmantel, till ympning, inkubation och avbildning av patogenen på växtblad. Detta protokoll kan optimeras för screening med hög genomströmning med något så enkelt som en smartphone för bildändamål.
Magnaporthe oryzae, risblastsvampen, infekterar ett sortiment av spannmålsgrödor, inklusive korn, vete och ris1. Denna patogen orsakar förödande sjukdomar och utgör ett världsomspännande hot mot dessa värdefulla grödor, vilket orsakar fullständig förlust av grödor om den inte kontrolleras. Många laboratorier runt om i världen fokuserar på risblastsjukdom på grund av dess globala hot och dess attribut som en utmärkt modell för växt-svampinteraktioner2. Det har sekvenserats fullständigt, och genetiken i dess infektionscykel, särskilt de tidiga händelserna, har fastställts 3,4. Livscykeln börjar med en spore som spirer på en bladyta och bildar den specialiserade penetrationsstrukturen som kallas appressorium. Appressoriet tränger in i bladvävnaden, och infektionen fortsätter med utvecklingen av lesioner som startar sporuleringsprocessen och sprider sjukdom4. Att förhindra någon av dessa tidiga händelser skulle drastiskt hämma denna förödande sjukdom. Följaktligen har den senaste forskningen om blastsjukdom varit inriktad på de tidiga infektionsstegen, från de grodda konidierna som bildar ett appressorium till utvecklingen av invasiva hyfer och det biotrofa gränssnittskomplexet (BIC)5.
Den stora mängden forskning om blastsjukdom har utförts i ris, även om M. oryzae är en betydande patogen för en mängd olika grödor, och nyutvecklade stammar framträder som ett globalt hot mot vete6. Medan ris är en av de tre bästa stapelgrödorna som används för att mata befolkningen, tillsammans med vete och majs, är korn det fjärde spannmålskornet när det gäller djurfoder och ölproduktion7. När hantverksölindustrin växer, så gör det ekonomiska värdet av korn. Det finns tydliga fördelar med att använda M. oryzae och korn som ett patosystem för att studera blast sjukdom. För det första finns det stammar av M. oryzae som bara infekterar korn, liksom stammar som kan infektera flera gräsarter. Till exempel infekterar 4091-5-8 främst endast korn, medan Guy11 och 70-15 kan infektera både korn och ris8. Dessa stammar är genetiskt lika, och infektionsprocessen är jämförbar9. För det andra, under vanliga laboratorie- och växthusförhållanden är korn lättare att odla, eftersom det inte har de komplicerade kraven på ris (kortfattad temperaturkontroll, hög luftfuktighet, specifika ljusspektra). Det finns också avbildningsutmaningar med ris på grund av bladytans hydrofobicitet, som korn inte uppvisar10.
Detta protokoll presenterar en enkel metod för att isolera och effektivt utnyttja kornbladsmantlar för mikroskopisk analys av flera infektionssteg, med hjälp av vanliga laboratorietillbehör och en smartphone för datainsamling. Denna metod för analysen av kornbladmanteln är anpassningsbar för laboratorier över hela världen eftersom den kräver minimala leveranser och ändå ger en tydlig bild av den mikroskopiska interaktionen mellan patogenen och de första cellerna som den infekterar. Medan patogenicitetsanalyser, såsom en spray- eller droppinokulering, kan ge en makrovy av patogenens förmåga att bilda lesioner, tillåter denna analys forskaren att visualisera specifika steg av tidig infektion, från prepenetrationshändelser till kolonisering av epidermala celler. Vidare kan forskare enkelt jämföra infektion med vildtypsvampen med infektion med en mutant minskad virulens.
Det finns många vanliga analyser tillgängliga för att testa M. oryzae-stammar som ger en makroskopisk bild av ett kompatibelt eller inkompatibelt infektionssvar, såsom spray- eller droppinokuleringar, och användningen av klassificeringssystem för att kvantifiera lesionsstorlekarna13,14. En annan vanlig analys för M. oryzae är att testa patogenens förmåga att bilda sin specialiserade penetrationsstruktur, apppressorium…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner finansiering från USDA-NIFA-utmärkelsen 2016-67013-24816.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |