该协议描述了微呼吸测量系统的设置和运行,该系统可用于研究珊瑚全息的生理特征。
代谢活动被定义为涉及能量的有机过程的总和,对于理解地球上生命的功能和进化至关重要。因此,测量生物体代谢率是解释生物体生理状态、生态作用以及环境变化对陆地和水生生态系统中物种的影响的核心。在珊瑚礁上,新陈代谢测量已被用于量化珊瑚与其专性藻类共生体(共生藻科)之间的共生功能,以及评估包括气候变化在内的环境压力源将如何影响珊瑚健康。尽管具有这种重要性,但缺乏与珊瑚后代代谢率测量相关的方法和数据,这可能是由于它们的体积小。为了弥补这一差距,本研究旨在开发一种定制装置,用于测量小型(毫米级范围)海洋动物生态的呼吸作用。这种低成本和简单的设置应该可以改善代谢率的测量。这对于利用珊瑚的有性生产进行珊瑚礁恢复的应用生态研究至关重要。
呼吸是一种关键的生物学测量,它标志着生物体的整体代谢活动,但与其他关键性状(生长)一样,很难在小型生物体中测量 1。呼吸可以定义为通过使用氧气氧化有机分子。这个过程产生细胞功能(即新陈代谢)所需的化学能,这对生物体的生存至关重要。或者,厌氧代谢导致氧债务2。呼吸速率可以使用验光仪来确定,该验光仪测量密闭腔室中氧气浓度随时间推移的使用情况(以及因此降低),这种做法通常称为呼吸测量法 3。鉴于大多数生物体不储存氧气,新陈代谢率可以通过呼吸和碳使用之间的直接相关性来推断。正因为如此,呼吸速率可以转换为每日碳使用量,这为关键的代谢功能提供信息,如生长、繁殖和在环境压力时期维持代谢稳态的能力 4,5,包括通常导致压力或珊瑚白化的热浪条件。
全球珊瑚礁正在加速减少。珊瑚动物拥有一个由合作伙伴组成的联盟(包括甲藻共生菌科、真菌、细菌和病毒),统称为“holobiont”6。随着海洋温度的升高,珊瑚和珊瑚礁的生存压力越来越大,因为高温导致甲藻共生体科(以下简称共生体)的丧失,这种现象被称为漂白7。否则,寡营养热带水域中的珊瑚无法获得许多营养物质,包括无机氮和磷8。为了应对这种情况,珊瑚与它们的甲藻共生体(共生体)形成专性营养共生体,它们提供了珊瑚宿主生存和沉积碳酸钙骨架所需的大部分营养物质9。功能共生的特征可能是伴侣之间高水平的碳共享10,11,共生的调节涉及动态稳态12。
在热应激期间,这种动态调节和交流被破坏,导致生态失调和漂白(参考文献13 中已论述)。因此,代谢测量,如光合作用和呼吸作用,有可能阐明珊瑚的健康和不受调节的生态失调状态,准确测量个体发育中的这些过程对于理解生物体功能至关重要。随着大规模漂白事件的频率和幅度的增加,这一点尤为重要,有可能影响共生体营养共享的变化,其中碳转移已发现随着温度升高而减少14。这可能是由于共生体螯合营养物质的定向机制或硬生理权衡(热耐受性增加但宿主存活率降低15,16,17)。共生的破坏可能源于共生体和宿主,尽管一个主要因素可能是共生体的细胞功能障碍18。然而,海水温度升高引起的压力破坏了这种共生关系的稳定性;从共生体到宿主的碳共享减少19,20,珊瑚的饥饿可能会随之而来。这可能反映在珊瑚中的脂质和碳水化合物储存减少,这是由于宿主使用增加(“固定碳的分解代谢增加”),可能是由于共生体的共享减少11。除了光合作用和珊瑚共生体呼吸的贡献外,珊瑚动物的呼吸作用是了解珊瑚健康、这些伙伴之间漂白和营养交换的影响以及全息生物的生长的重要措施,全息生物是一种与生存环境变化相关的表型 8,21,22.最后,鉴于许多珊瑚是共生的,除了呼吸作用之外,使用呼吸测量法来表征光合作用对于将 P:R 比率置于上下文中并了解共生是否稳定特别有用(例如,参考文献23)。
因此,环境变化导致珊瑚及其共生体的能量预算发生变化,导致生长差异14.为了应对,珊瑚宿主可能会增加呼吸和脂质的使用,以满足其代谢需求;热应激会使净生产率降低 60%,因为呼吸增加14,通过溶解氧的变化来衡量。共生体科还可以增加氮的同化和碳保留14,24,然后利用这些储备将能量转移到它们自身的修复和保护机制25,26。N和C的平衡对于调节生长很重要,特别是P27,它可能表现为共生体丰度的动态调节。事实上,从大片珊瑚礁(>1,000公里)的珊瑚中收集的证据表明,宿主有能力通过调节磷来限制共生体的生长,尽管这因珊瑚物种而异27。
综上所述,这些研究表明,由于环境变化,耐热性增加,同时减少营养物质的产生或转移(即共生倾向)。因此,应使用强大的单幼方法,例如 通过 微呼吸计量化氧气使用量,以了解与新陈代谢相关的基本机制,然后应用于保护问题,例如了解耐热性获得。这里将其作为用于生理测量的微量呼吸测量工具,旨在查询珊瑚幼体与其藻类共生体之间的营养关系,但适用于其他小型海洋生物。
生物体对氧气的使用或产生可以通过将它们放入单独的、密封的呼吸测量室或“呼吸计”(以下简称腔室)中来测量,其中使用光学极管测量氧气变化 3.光电管是使用光脉冲测量氧浓度的探头,随时间变化的记录测量可以计算呼吸和/或光合作用速率。在实践中,测量呼吸作用类似于测量珊瑚的光合作用,只是珊瑚是在完全黑暗的情况下孵化的。从每日光合作用总量中减去珊瑚和共生体的每日总呼吸量,得出氧差(氧增量)2,3。一般来说,生物体消耗的氧气多于产生的氧气,导致缺氧。这可以转换为碳当量,因为氧气和碳以固定比例消耗 2。多余的碳可以被珊瑚用于生长、粘液合成和繁殖以及其他必要的代谢需求12.
该协议描述了一种微呼吸方法(图1),该方法用于测量单个珊瑚幼体的呼吸速率(R),使用定制的1.5mL玻璃室设计(带有GL25螺纹的小瓶,高20毫米,带有凸块/脊,平地边缘和带孔的螺旋盖;参见材料 表)填充0.5μm过滤海水。光纤光学极管(见 材料表)通过盖子侧面的孔插入每个腔室。每个单独的珊瑚都附着在磁力搅拌棒上方的硬网流通搅拌器板平台上方,以确保腔室内水的充分混合。在这里的代表性示例中,两个对照或“空白”(除了样品存在外相同的腔室)与三个重复的标本腔室同时测量,因为我们同时运行多个控制器。但是,设置示例(图 2)仅显示了四个通道的使用;这可以使用多个控制器和多个流通支架来增加。该系统中的温度也可以通过将每个腔室浸没在具有预设水温的定制水浴中来控制温度(此处示例数据中的高温应力为 27 °C,此处示例数据中的高温应力为 31 °C),使用循环流通(设置为 75 L/h 的连续、平缓流动)系统。搅拌板平台和带齿轮的搅拌板可以是任何尺寸,可以根据需要做成大或小,以适应玻璃室的数量。在这个例子中,平台和板大约是34厘米×26厘米×3厘米(材料表)。在每次运行之前,使用两种标准溶液对光电极进行校准,分别代表在适当的水温和盐度下,该实验设置的氧饱和度为 0% 和 100%。
这项工作概述了定制微呼吸测量装置的构建,该装置可用于量化小型无柄水生生物消耗和产生的氧气量。该协议的关键组件包括腔室的设置,包括光斑,以及使用 respR 软件包校准低信号,其中低信号可以定义为以浅或嘈杂斜率为特征的速率。定制腔室及其设置允许检测低信号,而 R 包的使用有助于防止出现浅或嘈杂的斜率可能导致结果误读(例如,假阳性)的问题。
其他用户可能需要进行的潜在修改包括将感兴趣的生物体固定在定制的腔室内。在这种情况下,使用一个小的刚性扎带和水族箱胶水将单个幼鱼固定在塑料底座上,然后将其粘在领带上。应该注意的是,在这个实验中,珊瑚幼体被安置在黑色塑料布上。这种塑料可以很容易地去除珊瑚幼体,这些幼体有效地从塑料上滑落,以免在去除过程中对它们造成身体伤害。珊瑚幼体附着在它们定居的基质上,因此建议将它们沉降在类似的塑料材料上,使用人造肽16 ,以方便它们在粘合过程中去除。为了进一步减少处理压力和对呼吸反应的影响,建议让安装在扎带上的珊瑚适应 1-2 周,这在许多成年珊瑚压力实验中很常见。可能需要进行其他修改,以将生物体固定在盖子上的斑点上方并允许水循环。另一个关键的故障排除步骤涉及信号检测,特别是在应确定速率的氧气时间序列的斜率上。归根结底,这归结为使用良好的判断来排除明显不稳定的数据,以及 respR 中的函数,允许从一致选择的区域或通过识别数据的线性区域自动提取速率。有关如何执行此操作的更多示例,请访问 respR 网站。
开发这种方法是为了将呼吸下限的测量扩展到极小的无柄海洋无脊椎动物。明显的局限性是,与为较大生物质设计的方案相比,该方案可能更容易出现假阳性。然而,鉴于这是设计的目的 – 测量这些下限 – 这已被考虑在设计中,并且该过程可以与 respR 软件包一起使用,以更好地防止误报。同样重要的是要承认存在其他系统来测量呼吸30,以及测量小型生物体,包括对体积小于此的单个桡足类动物31 的呼吸测量(~0.5-1 mL),但要么昂贵,要么缺乏特定成分(搅拌能力)。然而,与商业系统(例如,Core Microplate系统)相比,该系统是开源的,成本相对较低。该系统还包含其他系统可能缺乏的关键方法考虑因素,例如搅拌。内部搅拌棒功能对于复制许多海洋生物(例如, 通过 游泳的桡足类动物)的自然水混合至关重要,这通常是不可能的,并且可能使数据在很大程度上无法使用。相比之下,其他可用的混合方法包括将整个呼吸计放置在一个巨大的摇杆工作台上,这需要额外的设备,并且混合或 通过 振动混合的成功有限,这可能会对生物体造成干扰。出于这个原因,这是唯一可以对幼年珊瑚或其他非常小的无柄生物进行呼吸测量的系统。作为参考,这里包括的标本的大小范围为 2.1 至 3.6 个息肉(仅相当于几个月大),最小到最大平均面积为 1.3 至 4.5 mm2。
呼吸测量法是生态学研究中的一项基本措施,为此目的存在许多方法。然而,这些现有方法中的大多数都针对高生物量样品,包括整条鱼、珊瑚碎片或海草32,33,34。这种方法是第一个使用个体珊瑚幼体的方法。此外,这种方法还有许多潜在的应用,因为它提供了有关生物体功能的关键生理信息。这对于希望表征基线健康估计的研究可能很重要35,了解急性或长期压力在珊瑚个体发育过程中的作用,例如热应激36,或提供管理人员可以设置的阈值以帮助保护和改善珊瑚礁的健康 37.鉴于珊瑚是一个整体,而共生体群落在这个阶段和整个生命的第一年相对灵活38,将呼吸测量数据与群落随时间的变化配对,以充分了解整个生物体的功能。重要的是,这种方法有助于“开放科学”技术,有助于为创建可以公开共享、改进和标准化的自定义实验设置提供大纲。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢 Sam Noonan 的帮助和建议,感谢 Sven Uthicke 使用初始呼吸测量室,感谢 Ben Shelab 的工程插图,感谢澳大利亚海洋科学研究所的呼吸测量室适配器和支架的定制加工研讨会。这些珊瑚是根据以下大堡礁海洋公园许可证收集的,编号为 AIMS G12/35236.1。珊瑚不需要道德许可。
Cost | |||
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers | LabGlass Party Ldt. | 1.5 ml | $407.26 |
1.1 lids | AIMS workshop | Vial GL25 thread | ~$10 |
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) | PyroScience | Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 | $41.25 AUD each |
1.3 individual organism | NA | NA | NA |
1.4 flow-through stand | AIMS workshop | Custom | included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through |
1.5 magnetic stirrer | Any manufactuer is suitable | NA | ~$2? |
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) | Labglass Pty Ltd, Stafford QLD | Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole | $50.9 AUD |
2 FireSting controller (2) | PyroSciences | NA | 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here. |
3 computer | NA | NA | NA |
4 heater/chiller | VWR International | NA | Small models around $4,000 AUD |
5 respirometry plate platform | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers) | $1250 AUD |
6 stirrer plate with gears (7) | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm | $1250 AUD |
8 powered by the motor | AIMS workshop | Custom | $700 AUD |
9 power supply | Non-specific | NA | ~$300 AUD |
Aquarium glue | Seachem reef glue | 20g | $14 |
Oxygen Logger Software | PyroScience | NA | NA |
Polypipe and connectors | John Guest | NA | $20 |
Sodium Sulfite | Sigma | S0505-250G (CAS number 7757-83-7) | $54 |