JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64826
, , , ,
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry,University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences,University of Texas Health Science Center at San Antonio

Summary

Dit protocol beschrijft de chirurgische blootstelling van het dorsale wortelganglion (DRG) gevolgd door GCaMP3 (genetisch gecodeerde Ca2 + indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ beeldvorming van de neuronale ensembles met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen tijdens het toepassen van een verscheidenheid aan stimuli op de ipsilaterale achterpoot.

Abstract

Ca2+ beeldvorming kan worden gebruikt als een proxy voor cellulaire activiteit, inclusief actiepotentialen en verschillende signaleringsmechanismen waarbij Ca 2+ het cytoplasma binnendringt of intracellulaire Ca2+ winkels vrijkomt. Pirt-GCaMP3-gebaseerde Ca2+ beeldvorming van primaire sensorische neuronen van het dorsale wortelganglion (DRG) bij muizen biedt het voordeel van gelijktijdige meting van een groot aantal cellen. Tot 1.800 neuronen kunnen worden gemonitord, waardoor neuronale netwerken en somatosensorische processen als een ensemble in hun normale fysiologische context op populatieniveau in vivo kunnen worden bestudeerd. Het grote aantal bewaakte neuronen maakt de detectie mogelijk van activiteitspatronen die moeilijk te detecteren zouden zijn met behulp van andere methoden. Stimuli kunnen worden toegepast op de achterpoot van de muis, waardoor de directe effecten van stimuli op het DRG-neuronensemble kunnen worden bestudeerd. Het aantal neuronen dat Ca 2+ transiënten produceert en de amplitude van Ca2+ transiënten duidt op gevoeligheid voor specifieke sensorische modaliteiten. De diameter van neuronen levert bewijs van geactiveerde vezeltypen (niet-schadelijke mechano versus schadelijke pijnvezels, Aβ-, Aδ- en C-vezels). Neuronen die specifieke receptoren tot expressie brengen, kunnen genetisch worden gelabeld met td-Tomaat en specifieke Cre-recombinasen samen met Pirt-GCaMP. Daarom biedt Pirt-GCaMP3 Ca2+ beeldvorming van DRG een krachtig hulpmiddel en model voor de analyse van specifieke sensorische modaliteiten en neuronsubtypen die fungeren als een ensemble op populatieniveau om pijn, jeuk, aanraking en andere somatosensorische signalen te bestuderen.

Introduction

Primaire sensorische neuronen innerveren direct de huid en dragen somatosensorische informatie terug naar het centrale zenuwstelsel 1,2. Dorsale wortelganglia (DRG’s) zijn cellichaamclusters van 10.000-15.000 primaire sensorische neuronen 3,4. DRG-neuronen vertonen verschillende grootte, myelinisatieniveaus en gen- en receptorexpressiepatronen. Neuronen met een kleinere diameter omvatten pijngevoelige neuronen en neuronen met een grotere diameter reageren meestal op niet-pijnlijke mechanische stimuli 5,6. Stoornissen in de primaire sensorische neuronen zoals letsel, chronische ontsteking en perifere neuropathieën kunnen deze neuronen gevoelig maken voor verschillende stimuli en bijdragen aan chronische pijn, allodynie en pijnovergevoeligheid 7,8. Daarom is de studie van DRG-neuronen belangrijk bij het begrijpen van zowel somatosensatie in het algemeen als veel pijn- en jeukaandoeningen.

Neuronen die in vivo vuren zijn essentieel voor somatosensatie, maar tot voor kort waren hulpmiddelen om intacte ganglia in vivo te bestuderen beperkt tot relatief kleine aantallen cellen 9. Hier beschrijven we een krachtige methode voor het bestuderen van de actiepotentialen of activiteiten van neuronen op populatieniveau in vivo als een ensemble. De methode maakt gebruik van beeldvorming op basis van cytoplasmatische Ca2+ dynamica. De Ca 2+ gevoelige fluorescerende indicatoren zijn goede proxy’s voor het meten van cellulaire activiteit vanwege de normaal lage concentratie cytoplasmatisch Ca2+. Deze indicatoren hebben gelijktijdige monitoring van honderden tot enkele duizenden primaire sensorische neuronen mogelijk gemaakt bij muizen 9,10,11,12,13,14,15,16 en ratten 17. De methode van in vivo Ca2+ beeldvorming die in deze studie wordt beschreven, kan worden gebruikt om reacties op populatieniveau op mechanische, koude, thermische en chemische stimuli direct te observeren.

Het fosfoinositide-bindende membraaneiwit Pirt komt op hoge niveaus tot expressie in bijna alle (>95%) primaire sensorische neuronen18,19 en kan worden gebruikt om de expressie van de Ca 2+ sensor, GCaMP3, aan te sturen om neuronactiviteit in vivo20 te monitoren. In dit protocol worden technieken beschreven voor het uitvoeren van in vivo DRG-chirurgie, Ca2+ beeldvorming en analyse in de rechter lumbale 5 (L5) DRG van Pirt-GCaMP3-muizen14 met behulp van confocale laserscanmicroscopie (LSM).

Protocol

Alle hier beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol dat is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het University of Texas Health Science Center in San Antonio. OPMERKING: Eenmaal gestart, moeten dierchirurgie (stap 1) en beeldvorming (stap 2) op een continue manier worden voltooid. Data-analyse (stap 3) kan later worden uitgevoerd. 1. Chirurgie en het beveiligen van het dier voor de rechterkant L5…

Representative Results

Figuur 4: Representatieve beelden van L5 dorsale wortelganglia van Pirt-GCaMP3 muizen. (A,D) Single frame hoge resolutie scans van L5 dorsale wortelganglia van Pirt-GCaMP3 muizen worden getoond. (B,E) . Gemiddelde intensiteitsprojecties van 15 frames Pirt-GCaMP3 L5 DRG ganglia van respectievelijk pa…

Discussion

Aanhoudende pijn is aanwezig in een breed scala van aandoeningen, slopende en / of het verminderen van de kwaliteit van leven voor ongeveer 8% van de mensen29. Primaire sensorische neuronen detecteren schadelijke stimuli op de huid en hun plasticiteit draagt bij aan aanhoudende pijn8. Hoewel neuronen kunnen worden bestudeerd in celkweek en explantaten, verwijdert dit ze uit hun normale fysiologische context. Chirurgische blootstelling van de DRG, gevolgd door Pirt-GCaMP3 Ca…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R01DE026677 en R01DE031477 (aan Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.), en een Rising STAR Award van het University of Texas system (Y.S.K.).

Materials

Anased Injection (Xylazine) Covetrus, Akorn 33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC Cal Zeiss 422642-9900-000
Cotton Tipped Applicators McKesson 24-106-1S
Curved Hemostat Fine Science Tools 13007-12
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
DC Temperature Controller Heating Pad FHC 40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated Forceps Fine Science Tools 11252-50
FHC DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Fluriso (Isoflurane) MWI Animal Health, Piramal Group 501017
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16221-14
GelFoam Pfizer 09-0353-01
Ketaset (Ketamine) Zoetis KET-00002R2
Luminescent Green Stage Tape JSITON/ Amazon B803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer Midmark 91305430
Micro dissecting scissors Roboz RS-5882
Micro dissecting spring scissors Fine Science Tools 15023-10
Micro dissecting spring scissors Roboz RS-5677
Mini Rectal Thermistor Probe FHC 40-90-5D-02
Operating scissors Roboz RS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice Johns Hopkins University N/A Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
SMALGO small animal algometer Bioseb In vivo Research Instruments BIO-SMALGO
Stereotaxic frame Kopf Model 923-B 923-B
td-Tomato C57BL/6J mice Jackson Laboratory 7909
Top Plate, 6 in x 10 in Newport 290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J mice Jackson Laboratory 17769
Zeiss LSM 800 confocal microscope Cal Zeiss LSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software Cal Zeiss Zen (Blue Edition) 2.6
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
  2. Wessels, W. J., Marani, E. A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).
  3. Schmalbruch, H. The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat. The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).
  4. Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice. The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).
  5. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).
  6. Liu, Y., Ma, Q. Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).
  7. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  8. Stucky, C. L., Mikesell, A. R. Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves. Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).
  11. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  12. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).
  13. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  14. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  15. MacDonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  16. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  17. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  18. Kim, A. Y., et al. a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1. Cell. 133 (3), 475-485 (2008).
  19. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  20. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  21. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  22. Mahadevan, A. S., et al. cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).
  23. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  24. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  25. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
  26. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
  27. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  28. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  29. Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).
  30. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  31. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  32. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  33. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).
  34. Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons. The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).
  35. Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. Regulators of G-protein signaling in receptor complexes. Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).
  36. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).
  37. Tan, C. H., McNaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  38. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  39. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  40. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  41. Harada, K., et al. Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging. Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).

Tags

In Vivo Calcium ImagingNeuronal EnsemblesPrimary Sensory NeuronsDorsal Root GangliaPeripheral AllodyniaPain HypersensitivityTrigeminal GangliaGeniculate GangliaGenetically Encoded SensorsVoltageCell Signaling MoleculesCyclic AMPSurgical ProcedureLumbar EnlargementTransverse ProcessL5 DRGIsoflurane Anesthesia

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia. J. Vis. Exp. (192), e64826, doi:10.3791/64826 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image