JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64826
, , , ,
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry,University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences,University of Texas Health Science Center at San Antonio

Summary

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3’ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

Abstract

Ca 2 + görüntüleme, aksiyon potansiyelleri ve Ca 2 + sitoplazmaya girişi veya hücre içi Ca 2 + depolarının salınımını içeren çeşitli sinyal mekanizmaları dahil olmak üzere hücresel aktivite için bir proxy olarak kullanılabilir. Farelerde dorsal kök ganglionunun (DRG) birincil duyusal nöronlarının Pirt-GCaMP3 tabanlı Ca2+ görüntülemesi, çok sayıda hücrenin aynı anda ölçülmesinin avantajını sunar. 1.800’e kadar nöron izlenebilir, bu da nöronal ağların ve somatosensoriyel süreçlerin in vivo popülasyon düzeyinde normal fizyolojik bağlamlarında bir topluluk olarak incelenmesine izin verir. İzlenen çok sayıda nöron, diğer yöntemler kullanılarak tespit edilmesi zor olacak aktivite kalıplarının tespit edilmesini sağlar. Uyaranlar, fare arka pençesine uygulanabilir ve uyaranların DRG nöron topluluğu üzerindeki doğrudan etkilerinin incelenmesine izin verir. Ca2+ geçicilerini üreten nöronların sayısı veCa2+ geçicilerinin genliği, spesifik duyusal modalitelere duyarlılığı gösterir. Nöronların çapı, aktif lif tiplerinin (zararlı olmayan mekanolara karşı zararlı ağrı lifleri, Aβ, Aδ ve C lifleri) kanıtını sağlar. Spesifik reseptörleri eksprese eden nöronlar, Pirt-GCaMP ile birlikte td-Domates ve spesifik Cre rekombinazları ile genetik olarak etiketlenebilir. Bu nedenle, DRG’nin Pirt-GCaMP3 Ca2 + görüntülemesi, ağrı, kaşıntı, dokunma ve diğer somatosensoriyel sinyalleri incelemek için popülasyon düzeyinde bir topluluk görevi gören spesifik duyusal modalitelerin ve nöron alt tiplerinin analizi için güçlü bir araç ve model sağlar.

Introduction

Primer duyusal nöronlar doğrudan cildi innerve eder ve somatosensoriyel bilgiyi merkezi sinir sistemine geri taşır 1,2. Dorsal kök gangliyonları (DRG’ler), 10.000-15.000 birincil duyusal nöronunhücre gövdesi kümeleridir 3,4. DRG nöronları farklı boyutlarda, miyelinasyon düzeylerinde ve gen ve reseptör ekspresyon paternleri sunar. Daha küçük çaplı nöronlar ağrıyı algılayan nöronları içerir ve daha büyük çaplı nöronlar tipik olarak ağrılı olmayan mekanik uyaranlara cevap verir 5,6. Yaralanma, kronik inflamasyon ve periferik nöropatiler gibi birincil duyusal nöronlardaki bozukluklar, bu nöronları çeşitli uyaranlara duyarlı hale getirebilir ve kronik ağrı, allodini ve ağrı aşırı duyarlılığına katkıda bulunabilir 7,8. Bu nedenle, DRG nöronlarının incelenmesi hem genel olarak somatosensation hem de birçok ağrı ve kaşıntı bozukluğunu anlamada önemlidir.

İn vivo ateşlenen nöronlar somatosensitasyon için gereklidir, ancak yakın zamana kadar, in vivo bozulmamış gangliyonları incelemek için kullanılan araçlar nispeten azsayıda hücre 9 ile sınırlıydı. Burada, nöronların aksiyon potansiyellerini veya aktivitelerini in vivo olarak popülasyon düzeyinde bir topluluk olarak incelemek için güçlü bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, sitoplazmikCa2 + dinamiklerine dayanan görüntüleme kullanır. Ca 2 + hassas floresan göstergeleri, normalde düşük sitoplazmik Ca2 + konsantrasyonu nedeniyle hücresel aktiviteyi ölçmek için iyi proxy’lerdir. Bu göstergeler, farelerde 9,10,11,12,13,14,15,16 vesıçanlarda 17 olmak üzere yüzlerce ila birkaç bin birincil duyusal nöronun aynı anda izlenmesine izin vermiştir. Bu çalışmada açıklanan in vivo Ca2+ görüntüleme yöntemi, mekanik, soğuk, termal ve kimyasal uyaranlara karşı popülasyon düzeyindeki tepkileri doğrudan gözlemlemek için kullanılabilir.

Fosfoinositid bağlayıcı membran proteini Pirt, hemen hemen tüm (% >95) birincil duyusal nöronlarda yüksek seviyelerde eksprese edilir 18,19 ve in vivo20 nöron aktivitesini izlemek için Ca2 + sensörü GCaMP3’ün ekspresyonunu sürmek için kullanılabilir. Bu protokolde, in vivo DRG cerrahisi, Ca2+ görüntüleme ve Pirt-GCaMP3 farelerinin sağ taraf lomber 5 (L5) DRG’sinde analiz yapmak için teknikler tanımlanmıştır14 konfokal lazer tarama mikroskobu (LSM) kullanarak.

Protocol

Burada açıklanan tüm prosedürler, San Antonio’daki Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirilmiştir. NOT: Bir kez başladıktan sonra, hayvan cerrahisi (adım 1) ve görüntüleme (adım 2) sürekli olarak tamamlanmalıdır. Veri analizi (adım 3) daha sonra yapılabilir. 1. Sağ taraf L5 DRG görüntüleme için hayvanın ameliyatı ve …

Representative Results

Şekil 4: Pirt-GCaMP3 farelerinin L5 dorsal kök ganglionlarının temsili görüntüleri. (A,D) Pirt-GCaMP3 farelerinin L5 dorsal kök ganglionlarının tek kareli yüksek çözünürlüklü taramaları gösterilmiştir. (B,E) . Uyaranların yokluğunda, sırasıyla panel A ve panel D’den 15 kare P…

Discussion

Kalıcı ağrı, çok çeşitli bozukluklarda mevcuttur, insanların yaklaşık% 8’i için yaşam kalitesini zayıflatır ve / veya azaltır29. Birincil duyusal nöronlar ciltteki zararlı uyaranları tespit eder ve plastisiteleri kalıcı ağrıya katkıda bulunur8. Nöronlar hücre kültüründe ve eksplantlarda incelenebilirken, bunu yapmak onları normal fizyolojik bağlamlarından uzaklaştırır. DRG’nin cerrahi maruziyeti, ardından Pirt-GCaMP3 Ca2 + gör?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibeleri R01DE026677 ve R01DE031477 (Y.S.K.’ye), UTHSCSA başlangıç fonu (YSK) ve Teksas Üniversitesi sisteminden (YSK) Yükselen STAR Ödülü ile desteklenmiştir.

Materials

Anased Injection (Xylazine) Covetrus, Akorn 33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC Cal Zeiss 422642-9900-000
Cotton Tipped Applicators McKesson 24-106-1S
Curved Hemostat Fine Science Tools 13007-12
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
DC Temperature Controller Heating Pad FHC 40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated Forceps Fine Science Tools 11252-50
FHC DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Fluriso (Isoflurane) MWI Animal Health, Piramal Group 501017
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16221-14
GelFoam Pfizer 09-0353-01
Ketaset (Ketamine) Zoetis KET-00002R2
Luminescent Green Stage Tape JSITON/ Amazon B803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer Midmark 91305430
Micro dissecting scissors Roboz RS-5882
Micro dissecting spring scissors Fine Science Tools 15023-10
Micro dissecting spring scissors Roboz RS-5677
Mini Rectal Thermistor Probe FHC 40-90-5D-02
Operating scissors Roboz RS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice Johns Hopkins University N/A Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
SMALGO small animal algometer Bioseb In vivo Research Instruments BIO-SMALGO
Stereotaxic frame Kopf Model 923-B 923-B
td-Tomato C57BL/6J mice Jackson Laboratory 7909
Top Plate, 6 in x 10 in Newport 290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J mice Jackson Laboratory 17769
Zeiss LSM 800 confocal microscope Cal Zeiss LSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software Cal Zeiss Zen (Blue Edition) 2.6
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
  2. Wessels, W. J., Marani, E. A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).
  3. Schmalbruch, H. The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat. The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).
  4. Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice. The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).
  5. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).
  6. Liu, Y., Ma, Q. Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).
  7. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  8. Stucky, C. L., Mikesell, A. R. Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves. Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).
  11. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  12. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).
  13. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  14. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  15. MacDonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  16. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  17. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  18. Kim, A. Y., et al. a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1. Cell. 133 (3), 475-485 (2008).
  19. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  20. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  21. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  22. Mahadevan, A. S., et al. cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).
  23. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  24. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  25. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
  26. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
  27. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  28. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  29. Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).
  30. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  31. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  32. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  33. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).
  34. Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons. The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).
  35. Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. Regulators of G-protein signaling in receptor complexes. Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).
  36. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).
  37. Tan, C. H., McNaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  38. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  39. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  40. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  41. Harada, K., et al. Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging. Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).

Tags

In Vivo Calcium ImagingNeuronal EnsemblesPrimary Sensory NeuronsDorsal Root GangliaPeripheral AllodyniaPain HypersensitivityTrigeminal GangliaGeniculate GangliaGenetically Encoded SensorsVoltageCell Signaling MoleculesCyclic AMPSurgical ProcedureLumbar EnlargementTransverse ProcessL5 DRGIsoflurane Anesthesia
check_url/it/64826?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia. J. Vis. Exp. (192), e64826, doi:10.3791/64826 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image