Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in insulineproducerende eilandjesclusters
Summary
De differentiatie van stamcellen in eilandjescellen biedt een alternatieve oplossing voor conventionele diabetesbehandeling en ziektemodellering. We beschrijven een gedetailleerd stamcelkweekprotocol dat een commerciële differentiatiekit combineert met een eerder gevalideerde methode om te helpen bij het produceren van insuline-afscheidende, van stamcellen afgeleide eilandjes in een schaaltje.
Abstract
Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC’s) in insuline-afscheidende bètacellen levert materiaal voor het onderzoeken van de bètacelfunctie en de behandeling van diabetes. Er blijven echter uitdagingen bestaan bij het verkrijgen van van stamcellen afgeleide bètacellen die native menselijke bètacellen adequaat nabootsen. Voortbouwend op eerdere studies zijn hPSC-afgeleide eilandjescellen gegenereerd om een protocol te creëren met verbeterde differentiatie-uitkomsten en consistentie. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een pancreasvoorloperkit tijdens fase 1-4, gevolgd door een protocol dat is aangepast op basis van een eerder gepubliceerd artikel in 2014 (hierna “R-protocol” genoemd) tijdens fasen 5-7. Gedetailleerde procedures voor het gebruik van de pancreasvoorloperkit en microtiterplaten met een diameter van 400 μm om pancreasvoorloperclusters te genereren, R-protocol voor endocriene differentiatie in een statisch suspensieformaat met 96 putjes, en in vitro karakterisering en functionele evaluatie van hPSC-afgeleide eilandjes, zijn inbegrepen. Het volledige protocol duurt 1 week voor de eerste hPSC-uitbreiding, gevolgd door ~5 weken om insulineproducerende hPSC-eilandjes te verkrijgen. Personeel met basistechnieken voor stamcelkweek en training in biologische tests kan dit protocol reproduceren.
Introduction
Bètacellen van de alvleesklier scheiden insuline af als reactie op stijgingen van de bloedglucosespiegel. Patiënten die onvoldoende insulineproductie hebben als gevolg van de auto-immuunvernietiging van bètacellen bij diabetes type 1 (T1D)1, of als gevolg van bètaceldisfunctie bij diabetes type 2 (T2D)2, worden doorgaans behandeld met exogene insuline. Ondanks deze levensreddende therapie kan het niet precies overeenkomen met de voortreffelijke controle van de bloedglucose zoals bereikt door dynamische insulinesecretie van bonafide bètacellen. Als zodanig lijden patiënten vaak aan de gevolgen van levensbedreigende hypoglykemische episodes en andere complicaties als gevolg van chronische hyperglykemische excursies. Transplantatie van menselijke kadavereilandjes herstelt met succes de strakke glykemische controle bij T1D-patiënten, maar wordt beperkt door de beschikbaarheid van eilandjesdonoren en moeilijkheden bij het zuiveren van gezonde eilandjes voor transplantatie 3,4. Deze uitdaging kan in principe worden opgelost door hPSC’s als alternatief uitgangsmateriaal te gebruiken.
De huidige strategieën voor het in vitro genereren van insuline-afscheidende eilandjes uit hPSC’s zijn vaak gericht op het nabootsen van het proces van embryonale pancreasontwikkeling in vivo 5,6. Dit vereist kennis van de verantwoordelijke signaalroutes en getimede toevoeging van overeenkomstige oplosbare factoren om kritieke stadia van de zich ontwikkelende embryonale alvleesklier na te bootsen. Het pancreasprogramma begint met de verbintenis tot definitief endoderm, dat wordt gekenmerkt door transcriptiefactoren forkhead box A2 (FOXA2) en geslachtsbepalende regio Y-box 17 (SOX17)7. Opeenvolgende differentiatie van definitief endoderm omvat de vorming van een primitieve darmbuis, die uitmondt in een achterste voordarm die de homeobox 1 (PDX1)7,8,9 van de pancreas en de twaalfvingerige darm tot expressie brengt, en epitheliale expansie in voorlopercellen van de pancreas die PDX1 en NK6 homeobox 1 (NKX6.1)10,11 tot expressie brengen.
Verdere inzet voor endocriene eilandjescellen gaat gepaard met de voorbijgaande expressie van pro-endocriene hoofdregulator neurogenine-3 (NGN3)12 en stabiele inductie van de belangrijkste transcriptiefactoren neuronale differentiatie 1 (NEUROD1) en NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. De belangrijkste hormoonexpressiecellen, zoals insulineproducerende bètacellen, glucagon-producerende alfacellen, somatostatine-producerende deltacellen en pancreaspolypeptide-producerende PPY-cellen, worden vervolgens geprogrammeerd. Met deze kennis, evenals ontdekkingen uit uitgebreide, high-throughput drug screening studies, hebben recente ontwikkelingen het mogelijk gemaakt om hPSC-eilandjes te genereren met cellen die lijken op bètacellen die in staat zijn tot insulinesecretie 14,15,16,17,18,19.
Stapsgewijze protocollen zijn gerapporteerd voor het genereren van glucose-responsieve bètacellen 6,14,18,19. Voortbouwend op deze studies, omvat het huidige protocol het gebruik van een pancreasvoorloperkit voor het genereren van PDX1+/NKX6.1+ pancreasvoorlopercellen in een vlakke cultuur, gevolgd door aggregatie van microtiterplaten in clusters van uniforme grootte en verdere differentiatie in de richting van insuline-afscheidende hPSC-eilandjes met het R-protocol in een statische 3D-suspensiecultuur. Kwaliteitscontroleanalyses, waaronder flowcytometrie, immunokleuring en functionele beoordeling, worden uitgevoerd voor een rigoureuze karakterisering van de differentiërende cellen. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van elke stap van de gerichte differentiatie en schetst de in vitro karakteriseringsbenaderingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft een hybride protocol in zeven fasen dat het mogelijk maakt om hPSC-eilandjes te genereren die in staat zijn om insuline af te scheiden bij glucoseprovocatie binnen 40 dagen na kweek in vitro. Van deze meerdere stappen wordt aangenomen dat efficiënte inductie van definitief endoderm een belangrijk startpunt vormt voor de uiteindelijke differentiatie-uitkomsten18,27,28. In het protocol van de fabri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de steun van STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF en de Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao en Shenghui Liang zijn ontvangers van de Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam is een ontvanger van de Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima is een ontvanger van de Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship en de CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. We danken Dr. Edouard G. Stanley van MCRI en Monash University oprecht voor het delen van de Mel1 INS GFP/W-lijn en de Alberta Diabetes Institute Islet Core voor het isoleren en distribueren van menselijke eilandjes. We erkennen ook de steun van de Life Sciences Institute Imaging and Flow Cytometry-faciliteiten van de University of British Columbia. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
- Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
- Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
- Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
- Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
- Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
- Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
- Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
- Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
