중추신경계(CNS) 종양은 소아 암 관련 사망의 주요 원인이며, 임상 시험에서 환자를 대상으로 하는 국소 면역 기반 요법이 점점 더 많이 테스트되고 있습니다. 이 프로토콜은 CNS 종양을 표적으로 하는 면역요법 주입의 전임상 평가를 위해 마우스에서 국소 캐뉼라 이식 방법을 설명합니다.
소아 CNS 종양은 화학 요법 및 방사선 요법의 발전에도 불구하고 소아 암 관련 사망의 대부분을 담당하며 예후가 좋지 않습니다. 많은 종양에 효과적인 치료법이 없기 때문에 면역 요법과 같은 보다 유망한 치료 옵션을 개발하는 것이 중요합니다. CNS 종양에 대한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법의 사용이 특히 중요합니다. B7-H3, IL13RA2 및 디시알로강글리오사이드 GD2와 같은 세포 표면 표적은 여러 소아 및 성인 CNS 종양의 표면에서 고도로 발현되어 이들 및 기타 표면 표적에 대해 CAR T 세포 요법을 사용할 수 있는 기회를 높입니다. 전임상 쥐 모델에서 CAR T 세포의 반복적인 국소 전달을 평가하기 위해, 현재 인간 임상 시험에 사용되는 유치 카테터를 요약하는 유치 카테터 시스템이 확립되었습니다. 정위 전달과 달리 유치 카테터 시스템은 여러 번의 수술을 사용하지 않고 반복 투여가 가능합니다. 이 프로토콜은 소아 뇌종양의 동소 쥐 모델에서 일련의 CAR T 세포 주입을 성공적으로 테스트하는 데 사용된 고정 가이드 캐뉼라의 종양 내 배치를 설명합니다. 마우스에서 종양 세포의 동소 주사 및 생착 후, 고정 가이드 캐뉼라의 종양 내 배치가 정위 장치에 완료되고 나사와 아크릴 수지로 고정됩니다. 그런 다음 치료 캐뉼러는 반복적인 CAR T 세포 전달을 위해 고정 가이드 캐뉼라를 통해 삽입됩니다. 가이드 캐뉼라의 정위 배치는 CAR T 세포를 외측 심실 또는 뇌의 다른 위치로 직접 전달하도록 조정할 수 있습니다. 이 플랫폼은 CAR T 세포의 반복적인 두개내 주입 및 이러한 파괴적인 소아 종양에 대한 기타 새로운 치료법의 전임상 테스트를 위한 신뢰할 수 있는 메커니즘을 제공합니다.
화학요법, 방사선 요법 및 수술의 개선에도 불구하고 중추신경계(CNS) 종양은 소아과에서 가장 치명적인 악성 종양입니다1, 보다 성공적인 결과를 위한 새로운 접근법의 중요한 필요성을 강조합니다. 면역요법 분야에서 상당한 발전이 이뤄짐에 따라 입양 세포 치료(ACT) 접근법은 다양한 암, 특히 혈액 악성 종양에서 유망한 결과를 보여주었다2. ACT의 특정 유형인 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 T 세포의 특이성을 재지정하여 종양 표적 T 세포를 생성함으로써 유해한 세포를 인식하고 죽이는 면역 체계의 자연적인 능력을 이용합니다3. CAR T 세포 요법은 백혈병 및 림프종4의 치료에서 상당한 성공을 거두었으며, 이는 유망한 면역요법 접근법이 되고 고형 종양에 대한 연구를 장려합니다. 그러나 지금까지 고형 종양에서 CAR T 세포 요법은 임상적 성공을 거두지 못했으며 비효율적인 종양 침투, 제한된 표적 항원 및 억제 종양 미세환경과 같은 많은 문제에 직면해 있습니다5.
최근 임상 시험은 소아 CNS 종양에 대한 CAR T 세포 요법을 평가하기 시작했으며, 예비 보고서 6,7,8에서 개념 증명 및 T 세포 활성의 초기 증거를 제공합니다. 대부분의 초기 전임상 데이터는 CAR T 세포의 정맥내 전달에 초점을 맞추었지만, 최근의 전임상 증거는 CNS 9,10에서 국소 전달의 우월성을 시사했으며, 이는 또한 여러 임상 시험에서 성공적으로 활용되었습니다6,7,8,11. CNS에서 CAR T 세포의 국소 전달을 통합한 현재까지 전임상 연구는 정위적으로 전달되는 CAR T 세포의 단일 두개내 용량에 의존했습니다 9,10. 그러나 인간 을 대상으로 한 임상 시험에서는 CNS 6,7,8,11에 CAR T 세포를 반복적으로 주입해야 했으며, 이는 전임상 개발에서 여러 번의 반복 주입을 평가할 필요성을 강조합니다. 이 절차의 목표는 소아 뇌종양의 동소 쥐 모델에서 카테터를 사용하여 일련의 CAR T 세포 주입을 성공적으로 테스트하는 것입니다. 이 기술의 장점은 반복적인 CNS 내 치료를 제공하기 위해 여러 수술 절차를 피할 수 있다는 것입니다. 캐뉼라는 주로 신경전달물질의 미세투석 샘플링과 설치류의 신경과학 및 행동연구에서 신경활성 물질의 전달에 사용되어 왔다12, 항암 치료제 전달을 위한 캐뉼라의 사용에 대한 보고는 제한적이다. 이전 보고서를 기반으로 이 프로토콜은 CNS 종양의 이종이식 쥐 모델에서 CAR T 세포를 전달하기 위해 정위적으로 배치된 유치 캐뉼라 시스템을 사용합니다. 이 프로토콜은 신경 종양 또는 신경 종양 장애의 쥐 모델에서 추가 치료제를 테스트하는 데 사용할 수 있으며 혈액 뇌 장벽을 우회하는 것이 효능에 중요한 새로운 치료법을 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다.
CAR T 세포 요법은 혈액암 치료에 혁명을 일으켰으며 고형 뇌종양치료에 유망한 가치를 보여줍니다 6,7,8. 이 프로토콜은 소아 CNS 종양 치료를 위한 국소 CAR T 세포 전달의 전임상 평가를 가능하게 하도록 설계되었습니다. 캐뉼라 시스템은 소아 CNS 종양 6,7,8에서 CAR T 세포 요법의 진행 중인 임상 시험에서 현재 사용되고 있는 심실내 카테터 시스템인 Ommaya 또는 Rickham 저장소를 복제하여 이러한 방법의 관련성 및 번역 가능성을 강조합니다. 이 시스템은 혈액-뇌 장벽을 우회하는 CAR T 세포의 반복 전달을 허용하며, 이는 진행 중인 임상 시험에서 사용되는 방법과 유사합니다. 국소 전달은 CNS에서 최대한의 효능을 제공할 수 있다9 또한 순환으로 인한 밀매와 관련된 전신 독성의 위험을 감소시킬 수 있다15. 정위 전달은 CNS에 단일 선량을 제공할 수 있지만 이 시스템의 장점은 여러 번의 수술 없이 CNS의 지정된 위치에 여러 반복 선량을 제공할 수 있다는 것입니다. 이 절차의 한계에는 캐뉼라가 제자리에 있으면 위치를 변경하거나 조정할 수 없는 고정된 배송 장소와 캐뉼라가 빠질 가능성이 포함됩니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 치료 캐뉼라의 투영을 고려한 D/V 좌표에 고정 가이드 캐뉼라를 이식하는 것입니다. 치료 캐뉼라는 가이드 캐뉼라의 끝 너머로 돌출되므로 배치가 CAR T 세포를 관심 영역으로 전달하도록 주의를 기울여야 합니다. 치료 캐뉼라의 돌출 길이는 사용자 정의할 수 있으며 저자의 경험에 따르면 0.5mm는 유용한 돌출 길이입니다. 이 길이는 분배 시 치료제가 가이드 캐뉼라에 남아 있지 않도록 할 뿐만 아니라 관심 영역에 대한 가이드 캐뉼라에 대한 D/V 좌표를 크게 조정할 필요가 없습니다. 이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 CAR T 세포 주입 후 치료 캐뉼라가 제자리에 남아 있는 시간입니다. 치료 캐뉼라는 누출 및 CAR T 세포 요법의 국소 전달 손실을 방지하기 위해 주입 종료 후 최소 1분 동안 제자리에 유지되어야 합니다.
이 방법의 문제 해결은 간단하며 대부분의 합병증은 더미 캐뉼라를 제거하거나 치료 캐뉼라를 고정 가이드 캐뉼라에 삽입하는 데 어려움이 있으며, 이는 가이드 캐뉼라 내부의 마른 혈액으로 인한 것일 수 있습니다. 이것은 저항이 적고 파편이 제거될 때까지 가이드 캐뉼라를 통해 더미 캐뉼라를 부드럽게 통과시켜 쉽게 해결할 수 있습니다. 아크릴 수지는 때때로 두개골에서 떨어져 캐뉼라 시스템이 손실될 수 있습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 이것은 일반적으로 메스로 두개골을 채점하고 두 개의 나사를 배치함으로써 제한됩니다. 또한 마우스가 움직이는 동안 캐뉼라에 실수로 힘을 가할 수 있는 케이지의 모든 항목(예: 작은 구멍이 있는 특정 마우스 농축 오두막)이 제거됩니다.
결론적으로, CAR T 세포의 반복 전달을 위해 CNS 종양의 쥐 모델에 캐뉼라 시스템을 삽입하기 위한 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다. 캐뉼라 배치는 여러 지역 분만 위치에 맞게 조정하여 다양한 분만 부위의 효능을 테스트할 수 있습니다. 또한, 이 시스템은 혈액-뇌 장벽을 우회할 때 효능을 평가하기 위해 CAR T 세포 이외의 추가 치료제에 사용될 수 있으며, 또한 비종양학적 장애의 쥐 모델에서 치료제의 평가에 유용할 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업을 위한 자금은 Matthew Larson Foundation, Grayson Saves Foundation, Hyundai Hope on Wheels Young Investigator Award, Kortney Rose Foundation, National Institutes of Health NCI K12 CA076931-19 및 1K08CA263179-01, 국방부 W81XWH-21-1-0221에서 제공했습니다.
18 G needles | BD | 511097 | 1 1/2 inch metal hub |
Acrylic resin liquid | Lang Dental | B1323 | |
Acrylic resin powder | Lang Dental | B1323 | |
Alcohol wipes | BD | 326895 | |
Centrifuge 5240 | Eppendorf | 5420000040 | Centrifuge |
Cotton tipped swabs | Puritan | 826-WC | Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500) |
Drill bit holder | P1 Technologies | DH-1 | Drill bit holder for D56-D70 |
Drill bit | P1 Technologies | D58 | 1.07 mm |
Dummy cannula | P1 Technologies | C315DCS-5/SPC | Configuration: Small cap; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
Flat tip screwdriver | P1 Technologies | SD-80 | Screwdriver |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Forceps |
Guide cannula | P1 Technologies | C315GS-5/SPC | Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal |
Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine | Pascal | 1151602 | |
MOXI Z Mini automated cell counter Kit | Moxi | MXZ001 | Cell counter |
NOD scid gamma (NSG) mice | Jackson Laboratory | 5557 | 6 to 12-week-old males and females |
Pasteur pipet | VWR | 14673-043 | |
PKG tubing | P1 Technologies | C313CT | Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm |
Porcelain 12 well plate | Flinn Scientific | AP6064 | |
Povidone iodine | Medline | MDS093943 | |
Scalpel | World Precision Instrument | 50-822-457 | Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6" Ruler |
Screws | P1 Technologies | 0-80 X 3/32 | 2.4 mm |
Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 940 | Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console |
Student fine scissors | Fine Science Tools | 91460-12 | Scissors |
Treatment cannula | P1 Technologies | C315IS-5/SPC | 33GA; Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
Treatment syringes | Hamilton | 87908 | 5 µL, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5"/PT3 |
Vactrap XL | Foxx Life Sciences | 305-4401-FLS | Vacuum System |