Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

التقييم في المختبر وفي الجسم الحي للمركبات النشطة بيولوجيا التي يتم التحكم فيها ضوئيا - الأدوية المرشحة المحتملة للسرطان علم الأدوية الضوئية

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/64902
Automatic Translation
*1,2, *2, 2, 1, 1, 1, 2, 2, 3,4, 3, 4, 3, 1,2,4
1Taras Shevchenko National University of Kyiv, 2Bienta/Enamine, 3Karlsruhe Institute of Technology, 4Lumobiotics
* These authors contributed equally

Summary

يقدم هذا البروتوكول مجموعة من التجارب المعتمدة لتقييم الببتيدات المضادة للسرطان القابلة للتبديل الضوئي ، والتي يمكن استخدامها في الفحص قبل السريري لهذه المركبات. وهذا يشمل تقييم السمية الخلوية في مزارع الخلايا 2D و 3D ، وتقييم كفاءة الأيزوميرة الضوئية خارج الجسم الحي (الأنسجة النموذجية) ، وفعالية الجسم الحي .

Abstract

المركبات النشطة بيولوجيا التي يتم التحكم فيها ضوئيا هي فئة ناشئة من الأدوية "الذكية" المرشحة. أنها توفر أمانا إضافيا في العلاج الكيميائي الجهازي بسبب تنشيطها الزماني المكاني الدقيق عن طريق توجيه ضوء حميد غير مؤين إلى موقع معين داخل جسم المريض. تقدم هذه الورقة مجموعة من الطرق لتقييم الفعالية في المختبر والكفاءة خارج الجسم الحي للتنشيط الضوئي للمركبات النشطة بيولوجيا التي يتم التحكم فيها ضوئيا بالإضافة إلى الفعالية في الجسم الحي في المراحل المبكرة من تطوير الدواء. يتم تطبيق المنهجية على الببتيدات السامة للخلايا المضادة للسرطان ، وهي النظائر المحتوية على الدياريلثين لمضاد حيوي معروف ، gramicidin S. يتم إجراء التجارب باستخدام 2D (الخلايا الملتصقة) و 3D (كروية) مزارع الخلايا لخط الخلايا السرطانية (سرطان الرئة لويس ، LLC) ، بدائل الأنسجة الحية (لحم الخنزير المفروم) ، ونموذج سرطان الطعم الخيفي (تحت الجلد LLC) في الفئران ذات الكفاءة المناعية. يتم اختيار المركبات الأكثر فعالية وتقدير نوافذ العلاج الضوئي الواقعية عبر الفحص المجهري الفلوري الآلي. يتم تحديد كفاءة التنشيط الضوئي في أنظمة الإضاءة المختلفة على أعماق مختلفة في نسيج نموذجي ، ويتم تطبيق جرعة الضوء المثلى في التجربة العلاجية النهائية في الجسم الحي.

Introduction

ظهرت المركبات النشطة بيولوجيا التي يتم التحكم فيها ضوئيا في العقود الأخيرة كعنصر واعد في العلاجات الكيميائية الآمنة للأمراض البشرية وللقضاء على الأورام الصلبة الخبيثة على وجه التحديد1. تحتوي هذه المركبات على شظايا قابلة للإيزوميريز الضوئي عكسيا (مفاتيح ضوئية جزيئية) ويمكنها التبديل بين الأيزومرات الضوئية غير النشطة والنشطة عند التشعيع بضوء بأطوال موجية مختلفة.

بالمقارنة مع نظائرها التي لا يمكن التحكم فيها ضوئيا ، قد تكون الأدوية التي يتم التحكم فيها ضوئيا أكثر أمانا لأنه يمكن إدخالها بشكل منهجي في جسم المريض بأشكال أقل نشاطا وغير سامة بشكل أساسي ، ثم يتم تنشيطها بالضوء فقط عند الضرورة ، كما هو الحال في الأورام والقرح والجروح. على الرغم من أنه يمكن العثور على العديد من العروض المثيرة لمثل هذه النماذج الأولية للأدوية الجزيئية في الأوراق الأكاديمية الحديثة2،3،4،5،6،7 ، إلا أن مجال علم الأدوية الضوئية السريرية - وهو تطبيق لمجموعات الأدوية / الأجهزة الطبية / الأمراض المعتمدة - غير موجود. علم الأدوية الضوئية لا يزال في مرحلة اكتشاف الأدوية ، والدراسات قبل السريرية المنهجية غير معروفة.

لقد أظهرنا مؤخرا فقط ميزة السلامة في الجسم الحي لبعض الببتيدات المضادة للسرطان التي يتم التحكم فيها ضوئيا ، وهي نظائر المضاد الحيوي الببتيد gramicidin S8. تحتوي هذه المشتقات التي يتم التحكم فيها ضوئيا على مفتاح ضوئي diarylethene (DAE) ، والذي يخضع لتحولات ضوئية عكسية بين ما يسمى بالأشكال الضوئية "المفتوحة الحلقة" الناتجة عن الضوء الأحمر والأشكال الضوئية "المغلقة الحلقة" الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية (الموضحة في الشكل 1 لأحد المشتقات ، المركب LMB002).

Figure 1
الشكل 1: الببتيد السام للخلايا المتحكم فيه ضوئيا LMB002 وإيزوميره الضوئي. تظهر قطعة اليوميات باللون الأحمر. اختصار: DAE = diarylethene. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

غالبا ما يتطلب العثور على النتائج وإجراء التحسين من الضرب إلى الرصاص فحصا في المختبر وفي الجسم الحي للمكتبات المركبة المناسبة 9,10. هنا ، نوضح منهجية مناسبة للفحص المنهجي عالي الإنتاجية للسمية الخلوية للمركبات التي يتم التحكم فيها ضوئيا. نحدد أيضا كفاءة الأيزوميرة الضوئية ، ونقدر جرعة الضوء في الأنسجة النموذجية ، ونقيم الفعالية في الجسم الحي للمرشحين الأفضل أداء. ويتوافق هذا النهج مع اعتبارات أخلاقيات البيولوجيا ورعاية الحيوان.

في هذا العمل ، يتم تعديل الطرق التقليدية قبل السريرية لتجنب الأيزوميرة الضوئية غير المنضبطة للمركبات المختبرة. الهدف العام من تطبيق هذه الأساليب المعدلة هنا هو تطوير استراتيجية عامة مباشرة وسريعة وتنتج بيانات ذات دلالة إحصائية لمقارنة الأنشطة في المختبر بشكل موثوق وترشيد اختبار الفعالية في الجسم الحي للمركبات القابلة للتبديل الضوئي لتحديد الرصاص ومواصلة التطوير.

تتكون الاستراتيجية من ثلاث خطوات متتالية. تتضمن الخطوة الأولى تحديد IC 50 (صلاحية الخلية الظاهرة بنسبة50 ٪) في التخفيفات التسلسلية للأشكال الضوئية النشطة وغير النشطة لمركبات نشطة بيولوجيا يتم التحكم فيها ضوئيا باستخدام ثقافات خلايا ثنائية الأبعاد (2D ، أحادية الطبقة) وثلاثية الأبعاد (3D ، كروية) والمجهر الفلوري الآلي عالي الإنتاجية متحد البؤر. تتم مقارنة نوافذ العلاج الضوئي فيما يتعلق بفرق IC50 بين الشكلين الضوئيين ، ويتم اختيار المرشحين الأفضل أداء. لا توجد ميزة محددة في تقييم السمية بواسطة الفحص المجهري الآلي ومنصات فحص السمية الخلوية الأخرى (المقايسات)11 ؛ يمكن تنفيذ نماذج الورم القائمة على الخلاياالأكثر تعقيدا 12 بسهولة في هذه المرحلة.

بالنسبة للمركبات المختارة في الخطوة 1 ، فإن الخطوة الثانية هي تقدير كفاءة التبديل الضوئي داخل الأنسجة بشكل واقعي كدالة للعمق من سطح الأنسجة المشع عن طريق تحديد كفاءة التبديل الضوئي للأشكال الضوئية الأقل نشاطا في بديل الأنسجة باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء مكتشفة بالأشعة فوق البنفسجية (HPLC) لمستخلصات العينات المشععة. في الجسم الحي ، يمكن دراسة كفاءة التبديل الضوئي ، لكننا نقترح استخدام بديل بسيط للأنسجة - لحم الخنزير المفروم. لقد اختبرنا صحة هذا النهج. قمنا بقياس تحويل مركباتنا القابلة للتبديل الضوئي في الجسم الحي على نموذج سرطان الفئران ولاحظنا نفس التحويل الضوئي تقريبا على عمق تم قياسه في التجارب السابقة مع الفئران8. يمكن استخدام أي نسيج اصطناعي بديل مناسب13 أو 3D نسيج / عضو مطبوع بيولوجيا14 أو مواد خزعة أو مادة حيوانية أخرى معفاة. ومع ذلك ، فإن هذا الإعداد هو حل وسط جيد لأنه اقتصادي وسريع وأخلاقي.

الخطوة الثالثة هي تحديد فعالية مضاد للسرطان في الجسم الحي في نموذج سرطان الفئران. تم اختيار المركبات التي تظهر خصائص متفوقة في التجارب في المختبر والتبديل الضوئي بكفاءة على عمق لا يقل عن 1-1.5 سم في أنسجة النموذج لهذه التجربة.

يمكن تطبيق هذا البروتوكول على المركبات التي تمتلك أنواعا مختلفة من المفاتيح الضوئية ، بشرط أن تكون أشكالها الضوئية (أو حالاتها الضوئية الثابتة ، PSS) مستقرة لفترة معقولة (بضعة أيام أو أكثر). للتوضيح ، يتم استخدام LMB002 المشتق من DAE الموصوف سابقا15. الأشكال الضوئية LMB002 مستقرة حراريا ويمكن تخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة عام على الأقل دون تدهور كبير. يتم اختيار خلايا سرطان الرئة لويس (LLC) لهذا في المختبر وفي الجسم الحي ، ولكن لا يتم فرض قيود على نوع الخلية. خلايا LLC ملتصقة ، قابلة للزراعة بسهولة في 3D ، وتستخدم لتوليد الأورام (كما هو موضح في المرجع16). في الجسم الحي تستخدم خلايا LLC لنمذجة العمليات النقيلية ويمكن أن تولد بسهولة أوراما صلبة في الفئران ذات الكفاءة المناعية بعد الحقن تحت الجلد. يمكن تطبيق هذه المنهجية في الجسم الحي عالميا على نماذج السرطان الأخرى17,18. ويرد أدناه وصف تفصيلي للتنفيذ التفصيلي لهذه الاستراتيجية.

Protocol

تم تنفيذ إجراءات رعاية الحيوان والتجارب وفقا للوائح المحلية والدولية لإجراء مشاريع بحثية تشمل المختبر (قانون أوكرانيا "بشأن حماية الحيوانات من القسوة" ، الاتفاقية الأوروبية لحماية الحيوانات الفقارية المستخدمة لأغراض تجريبية وعلمية أخرى (الاتفاقية الأوروبية ، ستراسبورغ ، 1986) ، التوجيه 2010/63 / EU بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية). تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البيولوجيا في شركة Bienta. تم استخدام الفئران C57BL / 6NCrl (الإناث البالغات التي تزن كل منها حوالي 20 جم) في هذه التجارب. يتم سرد المواد والكواشف والمعدات المحددة في جدول المواد.

1. تقييم IC50 ل LMB002 ("أشكال الحلقة المغلقة" و "الحلقة المفتوحة") باستخدام ثقافات الخلايا 2D و 3D LLC

  1. إعداد المخازن المؤقتة وحلول المخزون للمركبات
    ملاحظة: إعداد المخازن المؤقتة باستخدام الإجراءات القياسية. بدلا من ذلك ، استخدم الحلول المتاحة تجاريا.
    1. تحضير 10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بإضافة 14.2 جم من Na 2 HPO 4 ، 2.4 جم من KH 2 PO4 ، 80 جم من كلوريد الصوديوم ، و2جم من KCl إلى 1 لتر من الماء المقطر. أعد الأوتوكلاف 10x PBS وخففه إلى محلول 1x بإضافة 100 مل من محلول 10x إلى 900 مل من الماء المقطر. ثم قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    2. قم بإعداد برنامج PBS (DPBS) من Dulbecco بإضافة 4.78 جم من مسحوق DPBS إلى 1 لتر من الماء المقطر. حرك المحلول حتى يذوب كل المادة الصلبة ، وتحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ، واضبطه بإضافة 1 M NaOH أو 1 M HCl (الرقم الهيدروجيني 7.3-7.4). بعد الوصول إلى مستوى الأس الهيدروجيني المرغوب فيه ، قم بتصفية الوسط من خلال مرشح فراغ 0.22 ميكرومتر في خزانة معقمة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    3. قم بإعداد محلول عازلة 1 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) بإضافة 238.3 جم من HEPES إلى 1 لتر من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول باستخدام 1 M NaOH حتى الرقم الهيدروجيني 7.5. قم بالتصفية من خلال مرشح فراغ 0.22 ميكرومتر في خزانة معقمة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    4. تحضير محلول 1x trypsin-EDTA (EDTA = حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك) عن طريق تخفيف محلول 10x. للقيام بذلك ، أضف 5 مل من 10x Trypsin-EDTA إلى 45 مل 1x محلول PBS في أنبوب معقم سعة 50 مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    5. قم بإعداد وسط النسر المعدل (DMEM) الأساسي من Dulbecco عن طريق إضافة 13.4 جم من مسحوق الجلوكوز عالي DMEM و 3.7 جم من Na2CO3 إلى 1 لتر من الماء المقطر في أسطوانة قياس مع قضيب تحريك مغناطيسي يوضع على لوحة التحريك. حرك المحلول حتى يذوب كل المادة الصلبة ، وتحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ، واضبطه بإضافة 1 M NaOH أو 1 M HCl (الرقم الهيدروجيني 7.3-7.4). بعد الوصول إلى الرقم الهيدروجيني المرغوب فيه ، قم بتصفية الوسط من خلال مرشح فراغ 0.22 ميكرومتر في خزانة معقمة وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
    6. تحضير وسط DMEM الكامل بإضافة 100 مل من مصل الجنين البقري (FBS) ، و 10 مل من محلول البنسلين والستربتومايسين ، و 10 مل من محلول L-glutamine ، و 10 مل من 1 M HEPES buffer إلى 900 مل من DMEM الأساسي. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    7. إعداد حلول المخزون لمركبات الاختبار.
      1. لكل مركب ، قم بوزن دفعتين من 5.12 مجم (على سبيل المثال ، LMB002) في الشكل الضوئي المغلق الدائري إلى أنبوبي طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل (أحدهما بجدران شفافة والآخر أسود غير شفاف). تزن 2.28 مجم من التحكم الإيجابي (على سبيل المثال ، gramicidin S) في أنبوب حائط شفاف للغاية. أضف 100 ميكرولتر من DMSO النقي إلى كل عينة ودوامة لمدة 30 ثانية.
      2. قم بتزكيل محلول المخزون (LMB002) في أنبوب الجدار الشفاف من شكل "الحلقة المغلقة" إلى الشكل "الحلقة المفتوحة" عن طريق تشعيع المحلول بليزر 660 نانومتر (كثافة الطاقة الضوئية 0.6 واط / سم2) مع دوامة لضمان الخلط الشامل. استمر حتى يتغير اللون بشكل واضح من الأرجواني الداكن إلى البني الفاتح. يحفظ بعيدا عن الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
  2. 2D تجربة زراعة الخلايا - بذر الخلايا (اليوم 1)
    1. انقل 10 مل من الوسط الكامل DMEM من قارورة T-75 مع مزرعة خلية LLC إلى أنبوب معقم سعة 15 مل. نضح الوسط المتبقي بمضخة تفريغ.
    2. اغسل ثقافة الخلايا ب 5 مل من 1x DPBS ونضح المحلول بمضخة تفريغ.
    3. قم بتغطية الخلايا ب 3 مل من محلول 1x trypsin-EDTA واحتضان القارورة لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئويةفي جو CO 2 بنسبة 5٪.
    4. أوقف عمل التربسين عن طريق إضافة 6 مل من وسط DMEM (تم نقله مسبقا إلى أنبوب معقم) إلى دورق زراعة الخلايا الذي يحتوي على 1x محلول trypsin-EDTA وسحب المعلق عدة مرات لغسل الخلايا من جدران دورق زراعة الخلايا.
    5. انقل التعليق إلى أنبوب 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق. بعد الطرد المركزي ، نضح طقطاف بمضخة تفريغ. تجنب لمس حبيبات الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب.
    6. أعد تعليق الخلايا بإضافة 2 مل من وسط DMEM الكامل الطازج وسحب العينات عدة مرات.
    7. عد الخلايا عن طريق أخذ عينات من حوالي 15 ميكرولتر من المعلق في أنبوب 0.5 مل ، وإضافة 15 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق ، ونقل الخليط الذي تم الحصول عليه إلى غرفة عد الخلايا.
    8. بعد العد ، قم بإعداد 25 مل من تعليق الخلية لكل نقطة زمنية. بذرة 5000-10000 (8000 في المتوسط) خلايا / بئر LLC في 200 ميكرولتر من DMEM في 60 بئرا مركزية من صفيحة 96 بئرا ذات قاع شفاف وجدران سوداء غير شفافة. املأ الآبار ال 36 المتبقية ب DMEM النقي.
    9. ضع الألواح في حاضنة زراعة الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استخدم أغطية الألواح البلاستيكية تحتها لمنع التسخين غير المتكافئ للوحة السفلية.
  3. تجربة زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد - إضافة المركبات (اليوم 2)
    1. راقب الخلايا عن طريق الفحص المجهري الضوئي في الألواح حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -80٪.
    2. نضح الوسط من الآبار بمضخة تفريغ في خزانة معقمة. أضف 100 ميكرولتر من وسط DMEM الطازج المسخن مسبقا وضع الألواح في حاضنة زراعة الخلايا.
    3. تحضير التخفيفات التسلسلية لمركبات الاختبار والتحكم الإيجابي في ألواح البولي بروبلين الشفافة المعقم. قم بعمل الحلول التالية لقياسات النقطة الزمنية الفردية:
      ملاحظة: ابدأ بالأسهم في DMSO وقم بتخفيفها باستخدام DMEM ، ولكن لا تتجاوز 1٪ v / v من DMSO في أعلى تركيز نهائي.
      1. للحصول على محلول 128 ميكرومتر من gramicidin S ، أضف 1.3 ميكرولتر من محلول مخزون 20 mM إلى 198.7 ميكرولتر من DMEM.
      2. للحصول على محلول 256 ميكرومتر من LMB002 ، شكل "حلقة مفتوحة" ، أضف 1.3 ميكرولتر من محلول 40 مللي متر إلى 198.7 ميكرولتر من DMEM.
      3. للحصول على محلول 512 ميكرومتر من LMB002 ، شكل "مغلق حلقي" ، أضف 2.6 ميكرولتر من محلول مخزون 40 مللي متر إلى 197.4 ميكرولتر من DMEM.
    4. قم بإجراء ثلاث تكرارات إضافية للحصول على أربع مجموعات من كل نقطة تركيز. قم بإعداد سلسلة تخفيف مزدوجة عن طريق استنشاق 100 ميكرولتر من كل بئر بدء ، ونقلها إلى بئر مع 100 ميكرولتر من DMEM ، والخلط جيدا.
      ملاحظة: يتطلب العمل مع المركبات القابلة للتبديل الضوئي ضبط الإضاءة لمنع الأيزوميرة الضوئية الخلفية. يوصى بإطفاء الضوء في الخزانات المعقمة.
    5. الحصول على التركيزات النهائية للمركبات في الآبار (5-150 ميكرومتر) عن طريق نقل 100 ميكرولتر من المحاليل المحضرة في كل مرة في 56 بئرا مع 100 ميكرولتر من DMEM المضافة سابقا. أضف 100 ميكرولتر من DMEM في كل مرة في أربعة آبار لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.
    6. ألواح الغطاء بورق الألمنيوم أو غطاء بلاستيكي واقي غير شفاف لمنع التبديل الضوئي غير المنضبط. ضع الألواح في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية (باستخدام أغطية الألواح البلاستيكية الإضافية السفلية) لوقت الحضانة المختار (10 دقائق أو 60 دقيقة أو 24 ساعة أو 72 ساعة).
  4. تجربة زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد - التلوين والتصوير (الأيام 2-5)
    1. بعد الحضانة بالمركبات لفترات مختلفة ، أضف 50 ميكرولتر من محلول التلوين لكل بئر إلى الألواح التي تم تحضينها بمركبات لمدة 10 و 60 دقيقة. احتضان الأطباق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: قم بإعداد محاليل تلطيخ المخزون لكل نقطة زمنية بإضافة 8 ميكرولتر من محلول Hoechst 33342 20 mM (التركيز النهائي هو 5 μM) ، 32.5 ميكرولتر من محلول يوديد البروبيديوم (PI) 1 mM (التركيز النهائي هو 1 μM) ، و 650 ميكرولتر من FBS غير المعقم إلى 5,810 μL من 1x PBS غير المعقم. قم بتسخين FBS و PBS في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمنع الخلايا من التعرض لصدمة درجة الحرارة.
    2. قم بإجراء تصوير مضان آلي باستخدام عدسة موضوعية 20x.
    3. كرر نفس إجراء التلوين والتصوير (الخطوات 1.4.1 -1.4.2) للألواح التي تم تحضينها بمركبات لمدة 24 (اليوم 3) و 72 (اليوم 5) ساعة.
      ملاحظة: يتم عرض خرائط اللوحة ثنائية الأبعاد النموذجية في الشكل 2.
  5. تجربة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد - بذر الخلايا (اليوم 1)
    ملاحظة: تتطابق خطوات هذا القسم مع تلك الموصوفة لإعداد تجربة ثنائية الأبعاد لثقافة الخلية ، والحضانة مع المركبات المختبرة ، والتصوير (الخطوات 1.1-1.4.) ومع ذلك ، في هذه الحالة ، يتم تحضير الخلايا ككرويات ناضجة مدمجة في صفيحة قاع U منخفضة الالتصاق للغاية تبلغ 384 بئرا مع جدران سوداء غير شفافة. يسمح استخدام لوحة بهذا الحجم بمقارنة مركبين في تجربة واحدة.
    1. كرر الخطوات 1.2.1-1.2.9 من بروتوكول التجربة ثنائية الأبعاد مع مزرعة خلية LLC.
    2. بعد عد الخلايا ، قم بإعداد 25 مل من تعليق الخلية. قم بزرع 1000 خلية لكل بئر في جميع الآبار في 50 ميكرولتر من DMEM في صفيحة قاع U منخفضة الربط مكونة من 384 بئرا.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 40 × غرام لمدة 30 ثانية ويهز مع شاكر لوحة في 250 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة لهز الخلايا من جدران الآبار إلى أسفل.
    4. ضع الألواح في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 فوق أغطية الألواح البلاستيكية الإضافية لمنع التسخين غير المتكافئ لقاع اللوحة لمدة 48 ساعة.
  6. تجربة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد - إضافة المركبات (اليوم 3)
    1. راقب الخلايا الموجودة في الألواح عن طريق الفحص المجهري للتأكد من أن الأجسام الكروية الناضجة المدمجة قد تشكلت.
    2. تحضير التخفيف التسلسلي للمركبات المدروسة في ألواح البولي بروبلين الشفافة المعقمة. في هذه الحالة ، قم بتضمين مركب إضافي. قم بعمل الحلول التالية لقياسات النقطة الزمنية الفردية:
      1. للحصول على محاليل 175 ميكرومتر و 350 ميكرومتر من جراميسيدين إس ، أضف 1.8 ميكرولتر من محلول مخزون 20 مللي متر إلى 198.2 ميكرولتر من DMEM وأضف 3.6 ميكرولتر من المخزون إلى 196.4 ميكرولتر من DMEM في المقابل.
      2. للحصول على محاليل 175 ميكرومتر و 350 ميكرومتر من LMB002 ، شكل "حلقة مفتوحة" ، أضف 1 ميكرولتر من محلول مخزون 40 مللي متر إلى 199 ميكرولتر من DMEM وأضف 1.8 ميكرولتر من المخزون إلى 198.2 ميكرولتر من DMEM في المقابل.
      3. للحصول على محاليل 350 μΜ و 1,750 μM من LMB002 ، شكل "حلقة مغلقة" ، أضف 1.8 ميكرولتر من محلول مخزون 40 mM إلى 198.2 ميكرولتر من DMEM وأضف 8.8 ميكرولتر من المخزون إلى 191.2 ميكرولتر من DMEM في المقابل.
    3. قم بإجراء ثلاث نسخ متماثلة إضافية للحصول على أربع مجموعات من كل نقطة تركيز. الحصول على التخفيفات التسلسلية عن طريق سحب 20 ميكرولتر من كل بئر بدء ، ونقلها إلى البئر ، مع 180 ميكرولتر من DMEM ، والخلط جيدا.
      ملاحظة: يتطلب العمل مع المركبات القابلة للتبديل الضوئي ضبط الإضاءة لمنع الأيزوميرة الضوئية الخلفية. يوصى بإطفاء الأنوار في الخزانات المعقمة.
    4. الحصول على التركيزات النهائية للمركبات في الآبار عن طريق نقل 20 ميكرولتر من المحاليل المحضرة في كل مرة في 128 بئرا تحتوي على 50 ميكرولتر من DMEM. أضف 20 ميكرولتر من DMEM في كل مرة في ثلاثة آبار لتكون بمثابة عنصر تحكم. قم بتغطية الألواح بورق الألمنيوم أو التغطية الواقية البلاستيكية لمنع التبديل الضوئي أو التبخر.
    5. ضع الألواح في حاضنة زراعة الخلايا على أغطية الألواح البلاستيكية لوقت الحضانة المختار.
  7. تجربة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد - التلوين والتصوير (الأيام 3-6)
    1. قم بإعداد محلول التلوين لكل نقطة زمنية بإضافة 13 ميكرولتر من محلول 1 mM Calcein AM (التركيز النهائي هو 1 μM) ، 22 μL من محلول Hoechst 33342 20 mM (التركيز النهائي 33 μM) ، 40 μL من محلول PI 1 mM (التركيز النهائي هو 3 μM) ، 300 μL من FBS غير المعقم إلى 2,625 μL من 1x PBS غير المعقم. قم بتسخين FBS و PBS في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمنع الخلايا من التعرض لصدمة درجة الحرارة.
    2. بعد الحضانة لفترات مختلفة مع المركبات ، أضف 20 ميكرولتر من محلول التلوين لكل بئر إلى الآبار التي تم تحضينها بالمركبات لمدة 10 دقائق. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    3. قم بإجراء تصوير متحد البؤر مضان باستخدام عدسة موضوعية 20x.
    4. كرر نفس إجراء التلوين والتصوير للآبار التي تم تحضينها بمركبات لمدة 24 (اليوم 4) و 72 (اليوم 6) ساعة.
      ملاحظة: في هذه التجربة ، يتم استخدام calcein AM كمكون ثالث لمحلول التلوين متعدد الألوان. يتم تحليل الصور التي تم الحصول عليها من تجارب 2D و 3D باستخدام برنامج تحليل الصور الآلي للأداة. تعتبر الخلايا الملطخة بأصباغ Hoechst و propidium iodide ميتة نخرية ، ويتم استخدام جزءها كدالة للتركيز لحساب قيمة IC50 .

Figure 2
الشكل 2: مثال على خرائط اللوحات النموذجية لتجارب الثقافة ثنائية الأبعاد. يشار إلى رموز الألوان للمركبات والتحكم. يتم إعطاء تركيزات المركبات المختبرة (الأرقام داخل الآبار) بالميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تحديد كفاءة التبديل الضوئي في الأنسجة البديلة

  1. قم بتجميع القطار البصري لتشعيع العينة كما هو موضح في الشكل 3 (يتكون من كابل بصري من مصدر ضوء الليزر ، وعدسة ذات بعد بؤري متغير ، وحقنة ذات غطاء غير شفاف ، ونهاية قطع مسطحة).
    1. من خلال تغيير البعد البؤري وفتحة العدسة ، احصل على شعاع مسطح من الضوء بقطر أكبر بمقدار 1-1.5 مم من القطر الداخلي للمحقنة المستخدمة ولكنه لا يزال ، قدر الإمكان ، داخل الفتحة.
  2. استخدم حقنة سعة 5 مل بنهاية مقطوعة وقطر داخلي 12.4 مم ومغطاة بغطاء بلاستيكي غير شفاف. عند خرج طاقة ليزر يبلغ 200 ميجاوات ، اضبط كثافة الطاقة عند خرج النظام البصري على ~ 103 ميجاوات / سم2 كما تم قياسها باستخدام مقياس ضوئي.
    ملاحظة: يجب إجراء جميع العمليات اللاحقة في غرفة مظلمة مع الحد الأدنى من الإضاءة الممكنة في مكان العمل.
  3. قم بإعداد 3 مل من محلول مخزون LMB002 (شكل "مغلق حلقي") في برنامج تلفزيوني بتركيز 1 مجم / مل.
  4. قم بإعداد عينة أنسجة نموذجية محملة بالشكل الضوئي غير النشط ل LMB002 في حاوية بلاستيكية. في المدى النموذجي ، يتم خلط 5 جم من لحم الخنزير المفروم الطازج ميكانيكيا مع 277 ميكرولتر من محلول مخزون LMB002 و 260 ميكرولتر من PBS للوصول إلى التركيز النهائي البالغ 50 مجم / كجم في العينة ، ونسبة الأنسجة / PBS ~ 9/1 (v / v).
  5. املأ المحقنة بالعينة المحضرة ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء بالداخل ، وشكل سطحا مستويا في نهاية التعرض (القطع).
    ملاحظة: يجب أن تشغل أسطوانة العينة في المحقنة ~ 40 مم على طول المحور.
  6. قم بإشعاع العينة في القطار البصري كما هو موضح في الشكل 3 لمدة 9 دقائق و 44 ثانية ، المقابلة ل ~ 60 J / cm2 التعرض.
  7. قم بإعداد شرائح بسمك 4 مم من العينة بعد التعرض عن طريق دفعها عن المحقنة باستخدام المكبس وتقطيعها بمشرط. قم بوزن الشرائح ووضعها في أنابيب اختبار منفصلة وقم بتمييزها بمتوسط المسافة (مم) من السطح المشعع.
  8. قم بإعداد عينتين للتحكم (الكمية المثلى ، 0.5-0.7 جم) في أنابيب الاختبار: في واحدة ، اللحم المفروم الممزوج ب 10٪ (حجم) من PBS (54 ميكرولتر) ، وفي الأخرى ، عينة الأنسجة النموذجية التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.4 مشعة بواسطة ضوء ليزر 500 ميغاواط لمدة 10 دقائق لضمان تحويل جميع جزيئات LMB002 "المغلقة الحلقة" إلى شكل "حلقة مفتوحة".
  9. أضف خليط الأسيتونيتريل والماء (70٪ / 30٪ v / v ، مكمل ب 0.01٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) ، 1.4 مل / جم) لكل شريحة وعينات التحكم. خلط المحتويات جيدا باستخدام قضيب زجاجي.
  10. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل وأجهزة الطرد المركزي المخاليط في 5220 × غرام لمدة 20 دقيقة أو أجهزة الطرد المركزي في 20 × غرام لمدة 30 دقيقة مرتين لإزالة المواد غير القابلة للذوبان وجمع المادة الطافية.
  11. اجمع بعناية المواد الطافية (~ 0.7 مل) وطردها مرة أخرى عند 16000 × جم لمدة 30 دقيقة.
  12. اجمع المواد الطافية (~ 0.5 مل لكل منهما) وقم بتحليلها عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات الطور العكسي (RP HPLC) مع عمود C18 تحليلي ، وتدرج خطي A: B بنسبة 3.46٪ B / دقيقة ، ومعدل تدفق 2.0 مل / دقيقة ، و 100 ميكرولتر من الحجم المحقون. سجل الكروماتوجرام المكتشف بالأشعة فوق البنفسجية عند 570 نانومتر (الكشف عن شكل "الحلقة المغلقة") و 270 نانومتر (الكشف عن نموذج "الحلقة المفتوحة"). استخدم العينات غير المشععة (الخطوة 2.4) وعينات التحكم المشع (الخطوة 2.8) لتحديد أوقات الاحتفاظ المحددة لكلا الشكلين الضوئيين (eluent A: مائي 0.1٪ TFA ؛ eluent B: 90٪ acetonitrile-water ، 0,1٪ TFA) ومعايرة الطريقة.
  13. تحديد الكميات الفعلية من الأشكال الضوئية LMB002 في العينات التي تم تحليلها باستخدام منحنيات المعايرة التي تم الحصول عليها عن طريق أخذ وتحليل الكروماتوجرام لحلول LMB002 ذات التركيزات المعروفة. للمعايرة ، قم بإعداد محاليل LMB002 "مغلقة حلقيا" عن طريق تخفيف محلول المخزون (الخطوة 2.3) بخليط الأسيتونيتريل والماء (70٪ / 30٪ v / v مكمل ب 0.01٪ TFA) للحصول على 0.36 و 0.9 و 3.6 ميكروغرام لكل 100 ميكرولتر (الحجم المحقون) ؛ التدرج الخفيف ومعدل التدفق هما نفس الشيء كما في الخطوة 2.12.
  14. كرر التجربة (الخطوات 2.4-2.12) ثلاث مرات وارسم النسبة المئوية الطبيعية لكل شكل ضوئي على الرسم (النسبة المئوية) مقابل المسافة (من سطح الأنسجة المشععة). احسب الإحصائيات (أي الانحراف المعياري عند كل نقطة تركيز).

Figure 3
الشكل 3: الإعداد التجريبي لتحديد كفاءة التحويل الضوئي في أنسجة النموذج. (أ) صورة تخطيطية و (ب) صورة فوتوغرافية؛ 1 ، كابل بصري من مصدر ضوء الليزر ؛ 2 ، عدسة ذات طول بؤري متغير ؛ و 3 ، اللحم المفروم - LMB002 - خليط محلول ملحي مخزن بالفوسفات يوضع في 4 ، حقنة ذات غطاء غير شفاف وواجهة أمامية مقطوعة (كما هو موضح في (B) بدون الغطاء). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. في الجسم الحي تحديد فعالية مضادة للسرطان

ملاحظة: يظهر جدول التجربة ونقاط النهاية في الشكل 4. يجب أن تتوافق معايير رعاية الحيوان في فترة ما بعد المعالجة مع قواعد 3R - يجب أن يشمل السكن كثافة القفص المناسبة وتوافر الموارد. كلما أمكن ، التزم بطرق التعامل مع الحيوانات غير المكروهة مثل النفق أو الحجامة.

Figure 4
الشكل 4: جدول التجربة العلاجية في الجسم الحي . تعيين المجموعات التجريبية وتفاصيل العلاج ونقاط النهاية وجداول تحليل ما بعد الوفاة . الاختصارات: LLC = سرطان الرئة لويس. IV = عن طريق الوريد. SC = تحت الجلد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تحضير الخلايا السرطانية للتلقيح تحت الجلد (اليوم 0).
    1. مرور خلايا LLC في DMEM (4.5 جم / لتر جلوكوز) مع 10٪ FBS و 100 U / mL من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. احصد الخلايا باستخدام محلول 0.05٪ من التربسين-EDTA ، وأجهزة الطرد المركزي ، في DMEM الخالي من المصل.
    3. عد الخلايا وحدد صلاحيتها باستخدام مقياس الدم واختبار استبعاد التريبان الأزرق.
    4. تحضير معلق الخلية النهائي بتركيز 10 × 106 خلايا / مل في مزيج DMEM و Matrigel (1: 1). الحفاظ على تعليق على الجليد قبل الحقن.
  2. تلقيح الخلايا LLC (اليوم 0)
    1. ضع أنثى الماوس البالغة C57BL / 6NCrl (تزن ~ 20 جم) في غرفة الحث في آلة التخدير isoflurane. أداء التخدير في 5 ٪ من isoflurane وانتظر حتى الحيوان فاقد الوعي تماما.
    2. إزالة الفراء من منطقة التلقيح الخلوي عن طريق الحلاقة.
    3. تلقيح 5 × 105 خلايا LLC في ~ 100 ميكرولتر من DMEM: خليط Matrigel (1: 1) في الطرف الخلفي الأيمن.
      ملاحظة: كلما أمكن ، التزم بممارسة استخدام إبرة واحدة.
  3. الإدارة المركبة والإشعاع الضوئي
    ملاحظة: في 5-8 أيام بعد التلقيح ، تكون الحيوانات جاهزة للعلاج عندما تكون أورامها واضحة ووصلت إلى ~ 50-100 مم3 حجم. قم بإجراء جميع العمليات اللاحقة باستخدام LMB002 والفئران المعالجة بهذا المركب في ظل ظروف شبه مظلمة (مصباح LED واحد 4 واط على بعد 5 أمتار على الأقل من مكان العمل).
    1. قم بإذابة LMB002 (شكل "حلقة مغلقة") في محلول ملحي فسيولوجي معقم بتركيز 1 ملغم / مل لجرعة 5 ملغ / كغ (IV) للحصول على محاليل متجانسة زرقاء داكنة.
    2. قبل التشعيع ، قم بتجميع أربع مجموعات من ثمانية بشكل عشوائي وإزالة الفراء من الورم والمناطق المجاورة عن طريق الحلاقة.
    3. ضع فأرا في الحامل للحقن الوريدية وقم بتسخين ذيل الحيوان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لجعل وريد الذيل مرئيا.
      ملاحظة: النظر في تسكين ما قبل الجراحة.
    4. حقن المركب بمعدل 5 مل / كجم في الوريد الذيل. بالنسبة للمجموعتين الضابطتين ، قم بحقن 100 ميكرولتر من المحلول الملحي (عن طريق الوريد) لكل (20 جم من وزن الجسم). تأكد من أن الحيوانات في المجموعتين التجريبيتين تتلقى المركب المختبر في الشكل الضوئي غير النشط (1 مجم / مل في محلول ملحي).
      ملاحظة: كلما أمكن ، التزم بممارسة استخدام إبرة واحدة.
    5. ثم ، بعد 2 ساعة و 45 دقيقة من حقن المركب ، ضع الماوس تحت التخدير. تحفيز التخدير مع 3٪ -4٪ إيزوفلوران في الأكسجين. الحفاظ على التخدير لمدة 15 دقيقة مع 0.5٪ -1٪ إيزوفلوران في الأكسجين.
    6. قم بتغطية الماوس بقناع أسود يمتلك ثقبا يعرض منطقة الورم فقط للضوء.
    7. قم بتشغيل وحدة الصمام الثنائي بالليزر باستخدام ليزر 650 نانومتر واضبط قوة الليزر الأحمر على 200 ميجاوات وليزر التوجيه الأزرق / الأشعة فوق البنفسجية على 2 ميجاوات.
      ملاحظة: استخدم نظارات واقية زرقاء عندما يكون جهاز الليزر قيد التشغيل.
    8. قم بقياس تدفق الضوء من الليزر الأحمر (بعيدا عن الفئران) باستخدام مقياس ضوئي وحدد المسافة من الكبل البصري حيث يكون تدفق الضوء 100 ميجاوات / سم2. ثبت الكابل على حامل للتأكد من أن مصدر الضوء على مسافة محددة من الورم وأن الضوء يغطي منطقة الورم بأكملها. استخدم ضوء الليزر الأزرق / الأشعة فوق البنفسجية أثناء هذا الإجراء.
    9. قم بتشغيل الليزر الأحمر لإشعاع منطقة الورم لمدة 20 دقيقة.
    10. بعد التشعيع ، قم بإيقاف تشغيل تدفق isoflurane ، وأعد الحيوان إلى قفصه ، وراقب حالته بعناية خلال ال 30 دقيقة القادمة.
      ملاحظة: بعد الإدارة المركبة ، والحفاظ على الفئران في الظلام لمدة 2 أيام. يجب تغيير دورة النهار الضوئي فقط ؛ يجب أن تظل جميع ظروف السكن الأخرى دون تغيير.
  4. ملاحظات ما بعد العلاج
    1. مراقبة الحيوانات يوميا وقياس وزن وأبعاد أورامها. قياس حجم الورم ولاحظ تطور النخر.
      ملاحظة: يجب أن تتوافق معايير رعاية الحيوان في فترة ما بعد المعالجة مع قواعد 3R - يجب أن يشمل السكن كثافة القفص المناسبة وتوافر الموارد.
    2. استخدم البيانات التي تم جمعها في الخطوة السابقة لتقييم معدل الوفيات. تحديد معدل البقاء على قيد الحياة باستخدام الإجراء القياسي.
      ملاحظة: يجب التضحية بالحيوانات واعتبارها ميتة عند الكشف عن علامات سريرية شديدة (فقدان وزن الجسم بأكثر من 15٪ ، تقرح الورم لا يشفى في 7 أيام ، والنطق) أو بمجرد أن يصل حجم الورم إلى 2500 مم3.

Representative Results

في هذا العمل ، أجريت تجارب الخلايا ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد لتحديد IC50 لأشكال "الحلقة المغلقة" و "الحلقة المفتوحة" من LMB002 (انظر الشكل 1) في أوقات حضانة مختلفة. تمت مقارنة هذه القيم مع تلك التي تم الحصول عليها للببتيد الأولي ، gramicidin S (المستخدم كعنصر تحكم إيجابي). يظهر الشكل 5 مجموعة نموذجية من صور الحضانة في ثقافة 2D-grown LLC بعد تلطيخها . يشير التلوين المشترك مع Hoechst 33342 (الأزرق) ويوديد البروبيديوم (الأحمر) إلى ظلال مختلفة من اللون الأرجواني في جزء أكبر من الخلايا في حالة المعالجة بشكل "حلقة مفتوحة" مقارنة ب "الحلقة المغلقة" إلى اختلاف ملحوظ في السمية الخلوية بين شكلين يمكن قياسهما بسهولة. يعتمد المثال الموضح للتجربة الناجحة على البيانات التي تم جمعها باستخدام تنسيق لوحة 96 بئرا ، حيث تمت إضافة متغيرات الببتيد بتركيزات مختلفة ، كما هو موضح في الشكل 2. يمكن الحصول على بيانات مماثلة باستخدام 384 بئرا ولوحات عالية الكثافة. ومع ذلك ، نظرا لتقليل أحجام البئر ، فإن الأخطاء الفنية والمنهجية ، ونتيجة لذلك ، ستنخفض دقة تحديد IC50 مع زيادة كثافة البئر.

Figure 5
الشكل 5: صور تمثيلية من مقايسة السمية الخلوية في LLC أحادي الطبقة. كانت الخلايا ملطخة ب Hoechst 33342 (أزرق) ويوديد البروبيديوم (أحمر). الأوقات الموضحة: 10 دقائق و 60 دقيقة و 24 ساعة و 72 ساعة هي أوقات حضانة مع مركبات. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تحديد التحويل الضوئي ل LMB002 عن طريق تشعيع ضوء الليزر في نسيج نموذجي - لحم الخنزير المفروم الطازج - باستخدام عينة مكونة من لحم مفروم ممزوج ب LMB002 "حلقة مغلقة" (غير نشطة) مذابة في PBS وقياس تحويل هذا الشكل غير النشط إلى شكل LMB002 "حلقة مفتوحة" (منشطة) في اتجاه انتشار الإشعاع. تم وضع العينة في حقنة وتشعيعها من جانب واحد بحزمة مسطحة من إشعاع الليزر لفترة التعرض ~ 10 دقائق (تستخدم عادة في التجارب في الجسم الحي ) ، كما هو موضح في الشكل 3. بعد التعرض ، تم تقسيم أسطوانة العينة إلى أجزاء عن طريق الضغط على مكبس المحقنة وقطع شرائح من نفس الارتفاع بمشرط. تم تحديد تركيز LMB002 "الحلقة المفتوحة" في المستخلصات من الشرائح باستخدام RP HPLC.

يوضح الشكل 6 منحنيات تأثير الجرعة التي تم الحصول عليها من تحليل البيانات من 6A-D. لتحديد النسبة المئوية للخلايا الميتة ذات التلوين النووي المشترك لأصباغ Hoechst 33342 و PI ، استخدمنا أداة تصنيف مدمجة تحدد العتبات العددية عند المعلمات المقاسة المحددة لتقسيم جميع أعداد الخلايا إلى عدة فئات. على سبيل المثال ، عندما كانت إشارة القناة الحمراء (بروبيديوم يوديد) في عنصر التحكم عند العتبة (حوالي 110-130 وحدة) ، يمكن تصنيف الخلايا على أنها إيجابية PI ، أو تعتبر ميتة ، أو سالبة PI ، تعتبر غير متأثرة بالمركبات. بالنسبة ل LMB002 ، يمكن رؤية التبعيات السيني للنسبة المئوية للخلايا الإيجابية ليوديد البروبيديوم على تركيز المركب. من هذه البيانات ، يمكن تحديد قيم IC50.

Figure 6
الشكل 6: تحليل السمية الخلوية في ثقافة 2D. يناسب السيني كما تم الحصول عليه في ثقافة LLC لمدة (أ) 10 دقائق ، (ب) 60 دقيقة ، (ج) 24 ساعة ، و (د) 72 ساعة فترات زمنية مأخوذة للحضانة مع المركبات. يسمح التركيب بالتحديد الدقيق لقيم IC50 (غير معروضة). أشرطة الخطأ هي SEM. الاختصارات: LLC = سرطان الرئة لويس. PI = يوديد البروبيديوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالنظر إلى قيم IC50 التي تم الحصول عليها ، يمكننا أن نستنتج أن سمية المركبات الثلاثة زادت مع وقت الحضانة. كشفت تجربتنا أن الشكل "الدائري المفتوح" من LMB002 أقل سمية بحوالي خطوة تخفيف واحدة من النموذج الأولي للببتيد ، gramicidin S. في حين أن الشكل "المغلق الحلقي" يوضح ثلاث إلى أربع خطوات تخفيف أقل سمية ، والتي تزداد مع وقت الحضانة. لا يتأثر الفرق بين خطوتي التخفيف بالزيادة في وقت الحضانة ويمكن استخدامه عدديا كنافذة علاجية ضوئية محددة تجريبيا6 للمقارنة مع المركبات الأخرى في فحص المكتبة المحتمل. تم تعيين قيمة IC50 ل gramicidin S كنقطة مرجعية لتصحيح الأخطاء التجريبية أو المخرجات التفاضلية في النسخ المتماثلة البيولوجية.

أنتجت تجارب الخلايا 3D نفس النوع من البيانات الخام - الصور الكروية التي تم حلها بخلية واحدة لكل بئر. يتيح إدراج الكالسيين كصبغة تلطيخ ثالثة تحديد كمية جزء الخلايا النشطة الأيضية (التي لوحظت في القناة الخضراء). باستخدام 384 لوحة بئر ، وزيادة عدد النسخ المتماثلة التقنية ، باستثناء النقاط الزمنية للحضانة المشتركة الزائدة عن الحاجة ، وتغيير طية التخفيف ، تمكنا من مقارنة العديد من المركبات مباشرة في اختبار واحد (باستخدام لوحة واحدة) كما هو موضح في خريطة اللوحة في الشكل 7.

Figure 7
الشكل 7: خريطة لوحة لتجربة ثقافة 3D مع مركبين. يشار إلى رموز الألوان للمركبات والتحكم. الأرقام في الآبار هي تركيزات في ميكرومتر. 10 دقائق و 24 ساعة و 72 ساعة هي أوقات الحضانة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يعرض الشكل 8 صور النسخ المتماثلة التقنية المختارة من كرويات LLC المزروعة بكثافة 1 كروية / بئر في وجود مركبات مختبرة وكرويات التحكم التي تم التقاطها بعد التلطيخ.

Figure 8
الشكل 8: صور تمثيلية من مقايسة السمية الخلوية لثقافة 3D. تظهر الصور كرويات LLC عمرها 48 ساعة ملطخة ب Hoechst 33342 (أزرق) ، وكالسيين AM (أخضر) ، ويوديد البروبيديوم (أحمر) بعد 10 دقائق و 24 ساعة و 72 ساعة حضانة مشتركة مع كل من الأشكال الضوئية LMB002 و gramicidin S. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

باستخدام برنامج الأداة ، تم الحصول على منحنيات تأثير الجرعة ، مثل تلك الموجودة في تجربة 2D ، من أكوام الصور المكدسة ب z (الشكل 9A). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تمييز الأجسام الكروية المدمجة وغير المشوهة في الثقافات ثلاثية الأبعاد بقطر كروي كامل (الشكل 9 ب). ولوحظ أيضا أن القطر الكروي الكلي يختلف باختلاف تركيز المركب.

Figure 9
الشكل 9: تقييم السمية الخلوية مع الثقافات 3D. (أ) منحنيات تركيب السمية الخلوية المعتمدة على التركيز و (ب) مخططات قطر كروية تعتمد على التركيز تم الحصول عليها في الثقافات ثلاثية الأبعاد لشركة LLC التي تم تحضينها بشكل مشترك مع gramicidin S لمدة 10 دقائق و 24 ساعة و 72 ساعة وتم التقاطها قبل التلطيخ. أشرطة الخطأ هي SEM. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تسمح تجربة الخطوة 2 بتحديد تركيزات LMB002 في كلا الشكلين الضوئيين باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء مكتشفة بالأشعة فوق البنفسجية. تم تقييم كفاءة التحويل الضوئي في أنسجة النموذج بسهولة وقياسها باستخدام هذا الإعداد (الشكل 3). تم الحصول على البيانات من التحليل الكمي للكروماتوجرام لمقتطفات العينة. في تجارب الاختبار هذه ، تم الكشف عن كروماتوجرام LMB002 طيفيا عند 270 نانومتر و 570 نانومتر. عند 270 نانومتر ، لوحظت العديد من الإشارات الإضافية ونسبت إلى المركبات المستخرجة بشكل مشترك من نسيج النموذج (تم التحقق منها من مستخلص التحكم بدون المركب). كان كلا الشكلين الضوئيين مختلفين بما فيه الكفاية في أوقات الاحتفاظ والامتصاص. ومع ذلك ، تم فصل إشارة LMB002 "الحلقة المفتوحة" عن إشارات الخلفية هذه (انظر مخطط كروماتوجرام تمثيلي في الشكل 10A). لذلك ، يمكن دمج هذه الإشارة دون مشاكل. عند 570 نانومتر ، احتوت الكروماتوجرام على إشارة شكل LMB002 "مغلقة الحلقة" فقط (الشكل 10B). هنا ، أجرينا تحديد التركيز باستخدام RP HPLC. ومع ذلك ، يمكن تحقيق دقة أعلى وحدود كشف أقل باستخدام LC / MS كطريقة تحليلية.

Figure 10
الشكل 10: كروماتوجرام تمثيلي ل LMB002 مستخرج من أنسجة نموذجية. (أ) عينة على بعد 2 مم من السطح المشعع ، مسجلة عند 270 نانومتر (تم دمج شكل LMB002 "الحلقة المفتوحة") ؛ (B) عينة عند 38 مم من السطح المشع ، مسجلة عند 570 نانومتر (تم دمج ذروة LMB002 "الحلقة المغلقة"). بالإضافة إلى ذلك ، أكدت قيم وقت الاحتفاظ (المشار إليها) هوية المركب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم استخدام البيانات التي تم الحصول عليها بعد دمج الإشارات المقابلة لجميع العينات التي تم جمعها لبناء الرسوم البيانية لعمق التركيز ، كما هو موضح في الشكل 11. على أساس هذه الرسوم البيانية ، تم تقييم كفاءة التحويل الضوئي على أعماق مختلفة من أنسجة النموذج بسهولة. إنه يؤكد أن مصدر الضوء الأحمر الخاص بنا يحفز التحويل الضوئي LMB002 "المغلق حلقيا" على عمق يصل إلى 1 درجة مئوية ، في بديل الأنسجة ، اللحم المفروم (عند حوالي 103 ميجاوات / سم2).

Figure 11
الشكل 11: تقييم كفاءة التحويل الضوئي. تركيز (A ، ملغم / كغم) من أشكال LMB002 "مغلقة الحلقة" (غير نشطة ، نقاط زرقاء) و "حلقة مفتوحة" (تنشيط ، نقاط برتقالية) على مسافات مختلفة من السطح المشع للأنسجة النموذجية (L ، مم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تمثيل نتائج التجربة في الجسم الحي - الخطوة 3 من منهجيتنا التي أجريت وفقا للجدول الزمني الوارد في الشكل 4 - من خلال الرسوم البيانية التي توضح نمو الورم كدالة للوقت (الشكل 12) ومنحنيات بقاء كابلان ماير (الشكل 13).

Figure 12
الشكل 12: ديناميات نمو الورم في الحيوانات. الحيوانات المعالجة ب LMB002 مقارنة بالحيوانات المعالجة بالمركبات (نموذج الطعم الخيفي LLC تحت الجلد في الفئران C57BL / 6NCrl ، الجرعة المركبة 7 مجم / كجم ، IV ، حضانة 2 ساعة و 40 دقيقة ، ثم التشعيع عند 650 نانومتر ، 100 ميجاوات / سم2 ، 20 دقيقة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 13
الشكل 13: منحنيات وفيات الحيوانات. الحيوانات المعالجة ب LMB002 مقارنة بالحيوانات المعالجة بالمركبات (نموذج الطعم الخيفي LLC تحت الجلد في الفئران C57BL / 6NCrl ، الجرعة المركبة 7 مجم / كجم ، IV ، حضانة 2 ساعة و 40 دقيقة ، ثم التشعيع عند 650 نانومتر ، 100 ميجاوات / سم2 ، 20 دقيقة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

المركبات التي يتم التحكم فيها ضوئيا لم يسبق لها مثيل في تطوير الأدوية. ومع ذلك ، لم يتم إنشاء طرق لتقييمهم قبل السريري والسريري. أقرب علاج وحيد تناظري ، العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) ، هو طريقة العلاج للاستخدام السريري التي اعتمدتها العديد من البلدان ضد السرطان وهو قيد التطوير لمؤشرات أخرى19,20. على غرار علم الأدوية الضوئية ، يعتمد PDT أيضا على استخدام الضوء لتنشيط المادة النشطة بيولوجيا (الأكسجين المفرد). لذلك ، يمكن اعتماد بعض الطرق التجريبية المستخدمة للدراسات قبل السريرية والسريرية في PDT لعلم الأدوية الضوئية. على سبيل المثال ، مصادر الضوء ، ونهج توصيل الضوء ، والأجهزة الطبية متطورة بشكل جيد ومعتمدة ل PDT ؛ يمكن استخدامها مباشرة لتقييم الأدوية الخاضعة للرقابة الضوئية. ومع ذلك ، فإن PDT وعلم الأدوية الضوئية لهما العديد من الفروق عن بعضهما البعض4 ، مما يبرر الحاجة إلى إنشاء طرق محددة لهذا الأخير.

أولا ، المادة غير المنشطة في PDT (الأكسجين) موجودة دائما في الأنسجة الحية بتركيزات غير سامة. على النقيض من ذلك ، يمكن أن يكون للمركبات النشطة بيولوجيا غير النشطة التي يتم التحكم فيها ضوئيا نشاط متبقي وسمية غير مرغوب فيها. لذلك ، يجب أن تقلل الأدوية الضوئية المثالية من النشاط البيولوجي في شكلها المدار ويجب أن تكون نشطة للغاية في شكلها المولد بالضوء ، ويجب أن تكون "نافذة العلاج الضوئي"21 كبيرة قدر الإمكان. يتطلب العثور على الضربة والأداء الأمثل من الضرب إلى الرصاص تحديد المركبات المناسبة وفحص المكتبات الكبيرة نسبيا ، التي كانت بالفعل في المراحل المبكرة من تطوير الأدوية. هنا ، اقترحنا مجهرا فلوريا آليا عالي الإنتاجية لتحديد مركبات التبديل الضوئي الفعالة.

تسمح الطريقة المختارة لتقييم السمية الخلوية بالتنفيذ السهل للمتطلبات الأكثر أهمية - صيانة PSS أو استقرار الأيزومر الضوئي المرئي الحساس للضوء. هذا لأنه ، عند تنفيذه ، يتم تقليل التعرض للضوء. ومن ثم ، في حالة اختيار طرق بديلة ، يجب تفضيل الطرق الآلية. هذا النهج موثوق وغني بالمعلومات. يوفر استخدام ثقافات الخلايا 3D (كروية) في هذه المرحلة فهما شاملا لاستجابة الخلية للعلاج في بيئة دقيقة أكثر واقعية تشبه الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الحصول على رؤى قيمة حول آلية عمل المركبات باستخدام الفحص المجهري كطريقة مباشرة. يسمح المجهر الفلوري متحد البؤر مع بروتوكول التلوين المناسب بالتقييم البصري لمورفولوجيا الخلايا والأجسام الكروية. يمكن أيضا اكتشاف تفاصيل مهمة عن موت الخلية والتغيرات داخل الخلايا.

ثانيا ، يتطلب التطبيق الخفيف اختيارا دقيقا لجرعة الضوء. في PDT ، جرعة زائدة من الضوء ضارة للغاية للأنسجة22. يمكن أن يكون العلاج الدوائي الضوئي مفيدا في ظل التشعيع الضوئي المفرط. يتم تحديد الحد الأعلى للمادة المنشطة من خلال الجرعة المعطاة للمادة غير المنشطة وحركيتها الدوائية. ومع ذلك ، لا تزال الجرعة الخفيفة مشكلة في علم الأدوية الضوئية. يجب توخي الحذر لضمان أن كثافة طاقة التشعيع ووقت التعرض لا تقل عن متطلبات العلاج. من حيث المبدأ ، يمكن مراقبة توليد المادة المنشطة في الجسم الحي. ومع ذلك ، لأسباب تتعلق بأخلاقيات البيولوجيا ، اقترحنا تجربة مع نسيج نموذجي (لحم مفروم طازج) ممزوج بالمركب غير المنشط15. هذه التجربة بسيطة ويمكن تعديلها لاستخدام مصادر ضوء مختلفة. يمكن أيضا تكييفه للتقدير الضوئي الفيزيائي لجرعة الضوء وقياس التأثيرات الحرارية. هنا مرة أخرى ، باستخدام الأنسجة النموذجية ، من الممكن تقليل التعرض للضوء ، مقارنة ، على سبيل المثال ، بتحديد كفاءة التبديل الضوئي الأكثر دقة في ظروف الجسم الحي ، وهو بديل قد يكون من المثير للاهتمام دائما النظر فيه.

أخيرا ، يمكن اختيار المركبات التي تظهر خصائص متفوقة في شاشات السمية في المختبر والتبديل الضوئي بكفاءة على عمق 1-1.5 سم على الأقل في أنسجة النموذج لإجراء دراسات مكلفة وشاقة وطويلة في الجسم الحي . في هذا البروتوكول ، استخدمنا نفس خط الخلية (LLC) كما في التقييم في المختبر لإنشاء نموذج سرطان الطعم الخيفي. ديناميكيات نمو الورم ، والوفيات ، وعدد النقائل هي المعلمات الأكثر ملاءمة لتقييم فعالية مضاد السرطان. بالمقارنة مع العلاج الكيميائي التقليدي ، يتم تطبيق عامل إضافي في العلاج الضوئي - الضوء. لذلك ، هناك حاجة إلى مجموعتين من التحكم: واحدة تستقبل السيارة فقط والأخرى التي تستقبل السيارة والتشعيع. يتيح هذا الإعداد تقييم تأثير الضوء على المعلمات المقاسة. في تجربتنا ، تلقت المجموعتين التجريبيتين المركب غير المنشط ، وتم تشعيع أورام الفئران في مجموعة واحدة. كان نظام التشعيع متطابقا بالنسبة لمجموعات المراقبة والعلاج. المقارنة مع العلاج الكيميائي القياسي ليست ضرورية في هذه المرحلة لأن الغرض الرئيسي من التجربة هو إظهار التأثير المشترك للتطبيق الخفيف والمركب. يمكن بعد ذلك اختيار المركبات الأفضل أداء التي تظهر هذا التأثير لمزيد من الدراسة حول سميتها في الجسم الحي ومقارنتها بالمعايير لاتخاذ قرارات مهمة بشأن تطورها. من الناحية الفنية ، يمكن تكييف التجربة في الجسم الحي التي نصفها بسهولة مع دراسات الحرائك الدوائية أو الديناميكا الدوائية ، على سبيل المثال ، لمركب تم اختياره بالفعل كرصاص دوائي.

Disclosures

IVK و OB و SA و ASU هم مخترعون في عائلة براءات الاختراع الصادرة: "Peptidomimetics التي تمتلك نشاطا بيولوجيا يتم التحكم فيه ضوئيا" (WO2014127919 [A1] ، EP2958934 [B1] ، US9481712 [B2] ، UA113685 [C2]) مرخصة لشركة Lumobiotics GmbH. IVK و OB و TS و SA هم مؤسسو ومساهمون في Lumobiotics GmbH. IVK هو مستشار علمي ، هونج كونج ، TM ، IP ، و PB هم موظفون في Enamine LLC. ليس للمؤلفين أي انتماءات أو مشاركة مالية أخرى ذات صلة مع أي منظمة أو كيان له مصلحة مالية أو تعارض مالي مع الموضوع أو المواد التي تمت مناقشتها في المنشور بصرف النظر عن تلك التي تم الكشف عنها.

Acknowledgments

يقر المؤلفون بتمويل الاتحاد الأوروبي من خلال برنامج H2020-MSCA-RISE من خلال مشاريع PELICO (# 690973) و ALISE (# 101007256). تم دعم هذا العمل من قبل DFG-GRK 2039 (SA و TS و ASU) ، وبرنامج NACIP التابع لجمعية هيلمهولتز (SA و ASU) ، و VIP + من BMBF (OB و ASU). نعترف بالدكتور سيرهي كونييف ، معهد كارلسروه للتكنولوجيا ، الذي قام بتصنيع مركب LMB002 ، وتنقيته وقدم المركب للدراسة. كما يشكر المؤلفون تشوبرينا ماكسيم التي صورت وجمعت الفيديو في أوكرانيا ، ولجميع المدافعين الشجعان عن أوكرانيا الذين جعلوا العمل التجريبي والكتابة والتصوير هذا المنشور ممكنا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1100 Series capillary LC system ALSI-Chrom (Agilent distributor) -
ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line ECACC 90020104
C57BL/6NCrl mice, female, inbred Charles River Strain code: 027
CelCulture, CO2 incubator Esco Micro CCL-170B
Corning Matrigel Basement membrane matrix Merck CLS354234
Corning, 384- well spheroid microplates Merck CLS3830
Fetal bovine serum Merck F7524
Gibco, DPBS Thermo Fisher Scientific 21600044
Gramicidin S Lumobiotics Custom synthesis
HyClone, DMEM/high glucose Cytiva SH30003.04
IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system Cytiva 29240358
Invitrogen, Calcein AM Thermo Fisher Scientific C1430
Isoflurane anesthesia machine ASA S/N ASA 1305
L-glutamine, 200 mM solution Merck G7513
LIKA-surgeon, diode surgery laser Fotonika plus -
LMB002 Lumobiotics Custom synthesis
Penicillin–Streptomycin, solution stabilized Merck P4333
PhenoPlate, 96-well plates PerkinElmer 6055302
Photometer PCE-LED 20 PCE Instruments PCE-LED 20
Thermo Scientific, Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific 62249
Thermo Scientific, Propidium iodide Thermo Fisher Scientific J66764-MC
Trypan blue, 0.4% solution Merck T8154
Trypsin–EDTA, 10 x solution Merck T4174
UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 Santa Cruz Biotechnology sc-200263
UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm Santa Cruz Biotechnology sc-360882
Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) Altmann Analytik (Avantor distributor) GR5103827

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fuchter, M. J. On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist's perspective. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).
  2. Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L. Molecular photoswitches in aqueous environments. Chemical Society Reviews. 50, 12377-12449 (2021).
  3. Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. Optical control of neuronal ion channels and receptors. Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).
  4. Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D. In Vivo Photopharmacology. Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).
  5. Ma, X., et al. In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior. Nature Methods. 20, 682-685 (2023).
  6. Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance. Pharmaceuticals. 16 (5), 682 (2023).
  7. Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. Neuromethods. Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. 186, Humana, New York, NY. (2022).
  8. Babii, O., et al. Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol. Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28 (2020).
  9. Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C. Components of successful lead generation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (4), 421-439 (2005).
  10. Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).
  11. Kleijn, A., et al. A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
  12. Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. 3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions. Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).
  13. Sittinger, M., et al. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques. Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).
  14. Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
  15. Babii, O., et al. Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).
  16. De Ridder, K., et al. Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays. Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124 (2022).
  17. Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
  18. Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions. Cancers. 9 (2), 19 (2017).
  19. Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).
  20. Hull, K., Morstein, J., Trauner, D. In vivo photopharmacology. Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).
  21. Babii, O., et al. Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).
  22. Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 199 ،
التقييم <em>في المختبر</em> وفي <em>الجسم الحي</em> للمركبات النشطة بيولوجيا التي يتم التحكم فيها ضوئيا - الأدوية المرشحة المحتملة للسرطان علم الأدوية الضوئية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Horbatok, K., Makhnii, T., Kosach,… More

Horbatok, K., Makhnii, T., Kosach, V., Danko, V., Kovalenko, A., Fatiushchenkov, S., Borysko, P., Pishel, I., Babii, O., Ulrich, A. S., Schober, T., Afonin, S., Komarov, I. V. In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology. J. Vis. Exp. (199), e64902, doi:10.3791/64902 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter