Стандартизация переноса между лабораториями проточных цитометров для обнаружения лимфоцитов у детей, вакцинированных против японского энцефалита
Summary
В этом исследовании был разработан метод, облегчающий перенос экспериментальных настроек и шаблонов анализа между двумя проточными цитометрами в двух лабораториях для обнаружения лимфоцитов у детей, вакцинированных японским энцефалитом. Метод стандартизации экспериментов с проточным цитометром позволит эффективно проводить исследовательские проекты в нескольких центрах.
Abstract
Все большему числу лабораторий необходимо собирать данные с нескольких проточных цитометров, особенно для исследовательских проектов, выполняемых в нескольких центрах. Проблемы использования двух проточных цитометров в разных лабораториях включают отсутствие стандартизированных материалов, проблемы совместимости программного обеспечения, несоответствия в настройке прибора и использование разных конфигураций для разных проточных цитометров. Для проведения стандартизированного эксперимента по проточной цитометрии для достижения согласованности и сопоставимости экспериментальных результатов в нескольких центрах был создан быстрый и осуществимый метод стандартизации для переноса параметров между различными проточными цитометрами.
Методы, разработанные в этом исследовании, позволили перенести экспериментальные настройки и шаблоны анализа между двумя проточными цитометрами в разных лабораториях для обнаружения лимфоцитов у детей, вакцинированных против японского энцефалита (ЯЭ). Между двумя цитометрами была получена постоянная интенсивность флуоресценции с использованием стандартных флуоресцентных шариков для установления настроек цитометра. Сопоставимые результаты были получены в двух лабораториях с разными типами приборов. Используя этот метод, мы можем стандартизировать анализ для оценки иммунной функции детей, вакцинированных ЯЭ, в разных лабораториях с разными инструментами, уменьшить различия в данных и результатах между проточными цитометрами в нескольких центрах и обеспечить осуществимый подход к взаимной аккредитации результатов лабораторных исследований. Метод стандартизации экспериментов с проточным цитометром обеспечит эффективное выполнение исследовательских проектов в нескольких центрах.
Introduction
Стандартизация проточной цитометрии полезна для сопоставимости результатов, полученных от разных цитометров в разных лабораториях и исследовательских центрах, и способствует взаимному признанию результатов для повышения эффективности работы. Все большее число сценариев требует стандартизации. В процессе разработки лекарств важна стандартизация проточной цитометрии, поскольку разработанный и валидированный анализ будет поддерживать весь процесс разработки лекарств от доклинического до клинического анализа. Проточные цитометрические методы часто передаются между фармацевтической промышленностью и сотрудничающими лабораториями1. Кроме того, важно получить сопоставимые данные многоцентровых клинических исследований. Например, в рамках многоцентрового проекта клинических исследований системных аутоиммунных заболеваний был разработан рабочий процесс стандартизации для получения сопоставимых данных многоцентровой проточной цитометрии2.
Стандартизация методов проточной цитометрии является сложной задачей. Проблемы, с которыми сталкиваются лаборатории, связаны с отсутствием стандартизированных материалов, проблемами совместимости программного обеспечения, несоответствиями в настройке приборов и использованием различных конфигураций между различными проточными цитометрами и расходящимися стратегиями стробирования между центрами 3,4. Поэтому важно провести анализ пробелов между лабораториями. Доступ к образцам, системы качества, квалификация персонала и конфигурация приборов должны быть проверены, чтобы убедиться в соблюдении требований.
В настоящее время у детей, привитых вакциной против японского энцефалита (ЯЭ), значительно снижается заболеваемость ЯЭ5. Мониторинг иммунных клеток периферической крови может помочь понять изменения клеточно-опосредованного адаптивного иммунитета после вакцинации и корреляцию между изменениями в подмножествах лимфоцитов периферической крови и эффектами вакцинации. Из-за ограниченной стабильности образцов цельной крови оценка эффективности вакцины часто проводится в нескольких центрах. Для этого анализа мы определили наивные CD8+ или CD4+ Т-клетки как CD27+ CD45RA+, Т-клетки центральной памяти (T CM) как CD27+ CD45RA-, эффекторные Т-клетки памяти (TEM) как CD27-CD45RA-, а терминально дифференцированные эффекторные Т-клетки памяти (TEMRA) как CD27-CD45RA+. CD19+ В-клетки могут быть разделены на популяции, которые экспрессируют CD27 по сравнению с IgD 6,7, наивные В-клетки экспрессируют CD27n В-клетки памяти (mBCs) могут быть идентифицированы на основе экспрессии IgD6, а регуляторные Т-клетки (Tregs) могут быть идентифицированы как CD4 + CD25 ++ CD127с низким 8. Для проведения стандартизированного эксперимента по проточной цитометрии для достижения согласованности и сопоставимости экспериментальных результатов в нескольких центрах был создан быстрый и осуществимый метод стандартизации для облегчения передачи протоколов между различными проточными цитометрами для обнаружения лимфоцитов в цельной крови детей, вакцинированных ЯЭ. Шесть здоровых детей (2 года) были набраны из Пекинской детской больницы Столичного медицинского университета. После первичной и бустерной вакцинации живой аттенуированной вакциной JE SA14-14-2 менее чем за 6 месяцев до этого у добровольцев были взяты образцы периферической крови. Высокосопоставимые данные были получены из различных инструментов в соответствии со стандартизированными процедурами, что полезно для многоцентровых оценок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Иммунофенотипирование подмножеств лимфоцитов периферической крови может помочь понять изменения клеточно-опосредованного адаптивного иммунитета после вакцинации у детей. В клинических применениях возникают непредвиденные ситуации, такие как несвоевременное обнаружение образцов …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RW был поддержан Пекинским фондом естественных наук, Китай (No 7222059), Национальным фондом естественных наук Китая (No 82002130), XZ был поддержан Инновационным фондом медицинских наук CAMS (No 2019-I2M-5-026).
Materials
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
Riferimenti
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
