Summary
Ett system för att samla in data från självinitierade individuella beteendesessioner i en social kolonibur presenteras. Effektiviteten av detta system demonstreras med hjälp av en automatiserad bedömning av räckvidd, vilket möjliggör karakterisering av motoriska funktionsnedsättningar efter stroke, potentiella beteendeförändringar relaterade till motivation, cirkadiska variationer och andra innovativa beroende variabler.
Abstract
Beteendetestning i råttmodeller används ofta för olika ändamål, inklusive psykologisk, biomedicinsk och beteendevetenskaplig forskning. Många traditionella tillvägagångssätt innebär individuella, en-till-en-testsessioner mellan en enda forskare och varje djur i ett experiment. Denna inställning kan vara mycket tidskrävande för forskaren, och deras närvaro kan påverka beteendedata på oönskade sätt. Dessutom medför traditionell bur för råttforskning en brist på berikning, motion och socialisering som normalt skulle vara typisk för arten, och detta sammanhang kan också snedvrida resultaten av beteendedata. Att övervinna dessa begränsningar kan vara värt besväret för flera forskningstillämpningar, inklusive studien av förvärvad hjärnskada. Här presenteras ett exempel på en metod för att automatiskt träna och testa enskilda råttors beteende i en kolonibur utan närvaro av människor. Radiofrekvensidentifiering kan användas för att skräddarsy sessioner till den enskilda råttan. Valideringen av detta system skedde i exemplet, där man mätte skicklig motorisk prestanda i frambenen före och efter stroke. Traditionella egenskaper hos beteendestörningar efter stroke och nya åtgärder som möjliggörs av systemet mäts, inklusive framgångsfrekvens, olika aspekter av dragkraft, kampanalys, initieringsfrekvens och mönster, sessionens varaktighet och cirkadiska mönster. Dessa variabler kan samlas in automatiskt med få begränsningar. Även om apparaten tar bort experimentell kontroll av exponering, tidpunkt och praxis, gav valideringen en rimlig konsistens i dessa variabler från djur till djur.
Introduction
Beteendeträning och testning med råttmodeller är viktiga inom otaliga forskningsområden, från utforskning av kognitiva processer till sjukdomstillstånd och mer1. Vanligtvis utförs denna träning och testning med enskilda djur i en-mot-en-sessioner, där en forskare manuellt tar bort djuret från deras hembur och tillfälligt placerar dem i någon form av apparat. Tyvärr finns det flera svårigheter och begränsningar med detta tillvägagångssätt. För det första kan beteendetestning ta mycket tid för forskare, och när utbildning är nödvändig blir det tidsåtgången ännu större. För det andra påverkar detta tillvägagångssätt automatiskt – eller till och med potentiellt förväxlar – de inhämtade uppgifterna, vilket har fastställts på andra ställen2. Dessa förväxlingsfaktorer är särskilt framträdande när man överväger anrikningsrelaterade variabler. Laboratorieråttor är traditionellt inhysta i små burar som är precis tillräckligt stora för en eller två råttor,och om det inte finns några löphjul kan de gå en livstid utan meningsfulla möjligheter att motionera. Dessutom kan isolerade bostäder vara en stor källa till stress hos en social art som råttan4. Några av dessa välfärdsrelaterade nackdelar påverkar sannolikt råttors fysiologi 5,6, vilket kan förhindra utvecklingen av arttypiska beteendeuttryck4 och påverka kvaliteten på gnagarmodeller som tillämpas på mänskliga sammanhang.
Forskare har under de senaste åren sökt flera olika lösningar på dessa problem. Den enklaste typen av lösning har varit att automatisera beteendetestning och träning 7,8,9,10, och därmed ta bort kravet på att en enda forskare ska ta hand om ett enda djur. En ytterligare lösning har varit att automatisera överföringen av djur till försökskammare11,12, vilket ytterligare tar bort behovet av mänsklig inblandning. Slutligen har flera uppställningar utforskats som gör det möjligt för djur att hållas i koloniburar med andra djur och med mer utrymme för utforskning och berikning13. Trots dessa fördelar kan sådana koloniuppställningar begränsa eller komplicera ansträngningarna att samla in individuellt differentierade beteendedata (se dock försök att använda datorseende)14,15. Om individuella beteendedata krävs kan det vara svårare eller mer komplicerat att identifiera och hämta djur från bisamhällen för beteendesessioner också. För närvarande finns det få system för att samla in individuella beteendedata från (berikade) koloniersom hyser 16,17,18.
Dessa nackdelar kan specifikt påverka forskningen om beteendemässiga effekter av förvärvad hjärnskada. För det första är det tydligt att närvaron och/eller könet av människor samt hanteringsmetoder påverkar gnagares beteende 2,19, och dessa variabler kan påverka råttornas beteende på olika sätt före vs. efter stroke. För det andra kan mänskligt beteende efter stroke försämras genom avsiktligt minskat engagemang med den rekommenderade dosen av rehabiliteringsövningar20. För närvarande tenderar gnagarexperiment att inte modellera den här typen av sammanhang, eftersom råttor inte är fria att välja att delta eller avstå från beteendesessioner.
Den här artikeln introducerar ett protokoll som är utformat för att underlätta individuell beteendetestning inom ramen för infästning av berikade kolonier. Detta tillvägagångssätt tar inte bara itu med begränsningarna i nuvarande praxis utan öppnar också vägar för att utforska innovativa åtgärder. En vändkors med en råtta (ORT) har utvecklats och kan fästas på en kolonibur, vilket gör det möjligt för djur att självständigt ta sig in i beteendekammare och initiera sina egna tränings- och testsessioner. Systemet är överkomligt; varje ORT kan monteras till låg kostnad (med tillgång till en 3D-skrivare). Tidigare utfördes validering av detta system med hjälp av en grundläggande operant kammare, vilket visade att djur konsekvent kunde tränas för att utföra en enkel operant spaktryckning utan närvaro av en försöksledare16. Frågan om huruvida denna konfiguration är tillämplig på andra scenarier är dock fortfarande olöst. Syftet är att validera effektiviteten av ORT-kolonins uppställning i burar, som tidigare varit etablerad, för att träna och kvantifiera färdighetsbeteende som är relevant för motorisk nedsättning efter en stroke. Konfigurationen användes för att generera nya variabler som vanligtvis inte utforskas inom strokeforskning. Dessa variabler inkluderar prestationsmått för uppgiften att nå kvalificerad räckvidd och mätningar av självinitiering, som kan vara relevanta för motivation och beslutsfattande. Dessutom upptäcktes effektivt stroke-inducerade förändringar i de cirkadiska mönstren för daglig självinitiering under hela 24-timmarsperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer och djurvård godkändes av University of North Texas institutionella kommitté för djurvård och användning (IACUC) och följde National Institutes of Healths guide för vård och användning av försöksdjur. Vuxna han- och honråttor av Long-Evans (400-800 g, 1,5 år gamla), som användes i den aktuella studien, hölls i koloniburar.
1. Förberedelse av utrustning
- Skaffa eller montera vändkorset med en råtta (ORT) enligt designfilerna och instruktionerna för konstruktion (se Supplementary File 1 och Supplementary Coding File 1). Se Butcher et al.16 för ytterligare information.
OBS: ORTs är specifika för råttans storlek, så en kolonibur bör innehålla djur som är ungefär lika stora. Om man inte vill självmontera ORT:er kan de köpas förmonterade (se Materialtabell). - Skaffa och bifoga en läsare för radiofrekvensidentifiering (RFID, se materialförteckningen) samt skaffa och injicera djur med RFID-taggar.
OBS: När du injicerar RFID full duplex (FDX) tags måste orienteringen vara vinkelrät mot RFID-antennen när råttan går genom ORT. I denna validering implanterades taggar subkutant mellan skulderbladet på ett plan parallellt med ryggraden. - Fäst RFID-antennen på röret på ORT.
- Konstruera och/eller erhålla de beteendeapparater och koloniburar som är lämpliga för den experimentella frågan. I det här exemplet användes specialbyggda koloniburar21,22 tillsammans med kommersiellt tillgängliga operanta kammare (se Materialtabell), även om vilken utrustning som helst teoretiskt sett skulle kunna användas.
OBS: Konkurrens mellan djur som hålls i kolonier om tillgång till beteendeapparaterna via ORT bör övervägas. Räkna med att behöva en ORT + beteendeapparat för varje 4 till 6 djur. - Fäst ORT(erna) mellan beteendeapparaten och koloniburen.
- Skär ett portalhål i beteendeapparaten och koloniburen med hjälp av ett roterande Dremel-verktyg (se Materialtabell) eller liknande instrument. Den inre diametern bör vara lika med den yttre diametern på den konstruerade ORT-tunneln.
OBS: ORT måste höjas några tum för att fungera, så en liten plattform eller stativ kommer att behövas för att justera koloniburen och apparathöjderna. - Installera RFID-system för att läsa av djur när de passerar genom ORT och, om så önskas, integrera det med beteendeapparaten.
2. Preoperativ beteendeträning
- Skaffa en kohort av råttor av samma storlek och introducera dem i koloniburen.
OBS: Djur som har fötts upp eller hållits i stor utsträckning i isolering eller med få artfränder kan ha svårare att utforska kammaren, särskilt när det handlar om att korsa sociala områden i kolonins bur. Djur bör exponeras för placering i grupp tidigt i livet för att undvika denna fallgrop. - Ta bort tillgången till alla manipulanda inom beteendeapparaten och ställ in kammaren så att den automatiskt levererar belöningar var 60:e sekund i genomsnitt när den är upptagen.
OBS: I den här studien användes sackarosvatten (30 % till 40 %) som belöning, men sötad kondenserad mjölk är också effektiv. - Träna alla råttor att regelbundet komma in i beteendeapparaterna via ORT.
- Minst en gång om dagen, kontrollera data för att säkerställa att alla djur kommer in i ORT. Om djur inte kommer in, sätt in ett föremål i pennstorlek i låsmekanismen för att förhindra att det låses tillfälligt så att djuren kan utforska mer fritt. Om djuren fortfarande inte kommer in, ta bort vändkorset och fäst en tillfällig sidovägg för att möjliggöra fri tunnelåtkomst till kammaren.
- När alla djur regelbundet kommer in i kammaren, lämna tillbaka låset (och vändkorset) och gör en ny bedömning.
OBS: Djur kan också ockupera ORT och kammaren som en tillfällig paus från andra råttor. Ett sätt att förhindra denna typ av monopolisering av kammaren är att fästa en extra ORT som överbryggar till en enkel isoleringskammare. - Introducera manipulandum - draghandtaget, i det här exemplet - och ställ in på högsta känslighet. Sätt in handtaget precis inuti lådan (upp till 2 cm) eller precis utanför lådan.
OBS: Målartejp kan framkalla räckviddsförsök om den fästs på baksidan av handtaget, precis utom räckhåll. - Minska frekvensen som belöningen (dvs. 30 % sackarosvatten) levereras automatiskt (t.ex. var 90-120:e sekund). Kom ihåg att vilken belöning som helst kan användas som passar experimentledarens behov och djurens preferenser.
- Kontrollera uppgifterna dagligen för att säkerställa att alla djur har lärt sig att aktivera spaken. Bete spaken och/eller ändra insättningsnivån tills alla djur drar.
- Avbryt automatisk leverans av belöningar så att de endast är tillgängliga via aktivering av draghandtaget.
- Om den tidigare satts in, dra tillbaka spaken varje dag (förutsatt att alla råttor fortsätter att dra på den indragningsnivån) med 0.25 mm till 0.5 mm tills spaken är i sitt slutliga läge, 1 cm till 1.25 cm utanför kammaren.
OBS: Den exakta positionen för spaken beror på storleken på råttorna. Se till att välja en position som resulterar i önskad topografi. - Starta en percentil eller annat träningsprogram för att progressivt öka de dragkrafter som krävs för att aktivera handtaget.
OBS: I den här studien användes ett percentilschema som anger kriteriet för förstärkning i den övre kvartilen av de föregående 15 svaren. Alternativt kan stegvisa ökningar av pull-kriteriet användas7. - När djuren på ett tillförlitligt sätt når det slutliga kriterieintervallet på 120 g-drag, ta bort percentilträningsprogrammet och fixera kriteriet för handtagsaktivering till en konstant på 120 g.
- Samla in baslinjedata vid detta kraftkrav tills framgångsfrekvensen har varit stabil (icke-trendig) i ungefär en vecka.
3. Framkallande av stroke
- Kirurgiskt inducera stroke hos alla djur i bur i kolonin samtidigt.
OBS: För att inducera stroke användes en endotelisk-1 modell av stroke, som har beskrivits på andra ställen23. - Låt djuren återhämta sig i traditionella burar, isolerade individuellt, i 3-7 dagar.
4. Postoperativ beteendetestning
- Efter återhämtning, återför djuren till kolonins bur med den ORT-fästa skill-reach-apparaten.
- Utför beteendetestningen och håll dragkraven på 120 g (följ steg 2) tills tillräckliga data har samlats in för att utvärdera underskott efter stroke (från en till flera dagar).
- Implementera eventuella oberoende variabler efter stroke eller återhämtningsrelaterade under de följande dagarna medan djuren har tillgång till kammaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Djuren tränades och testades med fyra honråttor i en kolonibur och fyra hanråttor i en separat kolonibur. Alla råttor lärde sig att passera genom ORTs på fyra dagar eller mindre. De fyra honråttorna uppnådde >85 % lyckade anfall vid 120 g kraftbehovet efter cirka 6 veckors träning och hanråttorna nådde samma kriterium på 10 veckor (jämfört med ungefär 3 veckor med standardträning med berövade råttor)7. Denna utbildningstid förlängdes avsevärt på grund av flera hårdvaru- och mjukvarufel som krävde kontinuerlig felsökning, mellan vecka 2 och 6. När dessa problem väl hade åtgärdats gick träningen smidigt, och det förväntas att efterföljande träningstidslinjer kommer att vara jämförbara med den nuvarande litteraturen7. Hanråttorna tränades också längre för att ge fler möjligheter för en hanråtta att börja dra; Han gjorde dock aldrig det och uteslöts från vidare analys och operation efter vecka 7. När råttans prestanda stabiliserades på baslinjen, erhölls 5 dagars baslinjedata före stroke för varje bur. Data begränsades till dagar då ORT var ansluten till buren under hela dagen (vissa dagar krävde tillfälliga frånkopplingar i djurhållningen). För den kvinnliga buren var baslinjedagarna 7, 8, 9, 10 och 12 dagar före stroke. För männen var baslinjedagarna 8, 9, 10, 11 och 13 dagar före stroke.
Under sina strokeinduktionsoperationer implanterades djuren i denna validering samtidigt med elektroder anslutna till trådlösa mottagningschips i antingen deras basala framhjärna (koordinater -5,8 mm anterior/posterior, 0,7 mm vänster medial/lateral, 8,3 mm dorsal/ventral) eller deras ventrala tegmentala område (koordinater -2,3 mm anterior/posterior, 3,3 mm vänster medial/lateral, 7,0 mm dorsal/ventral). Dessa implantat var avsedda att användas i ett efterföljande återhämtningsexperiment och är inte relevanta för valideringen av kolonibur och ORT som rapporteras här. Implantaten var utformade så att huden kunde stängas över dem, med de mottagande chipen placerade subkutant under den vänstra armen.
En hona dog under induktion av stroke. En annan hona började gå ner i vikt flera dagar efter återhämtningen, efter att aldrig ha dragit i handtaget efter stroken. Efter avlivningen konstaterades det att hon troligen hade fått en hjärnblödning någon gång efter stroken. Dessa två djur eliminerades helt från datauppsättningen, inklusive pre-stroke-bedömningen.
Efter stroke återupptog djuren inte omedelbart det regelbundna spakdragandet, även om de fortsatte att komma in i kammaren via ORT och måste uppmuntras genom korta sessioner av manuell formning (dvs. minskat spakavstånd och levererade belöningar beroende på att de närmade sig eller försökte dra i spaken). Honråttor drog inte under dag 4-7 efter slaget och fick därför extra hävstångsbete (dvs. en klick jordnötssmör på spaken) och manuell formning på dag 8-11. De började dra autonomt på dag 11. Hanarna fick återhämta sig fram till dag 6 baserat på tidigare erfarenhet med honorna. De drog inte under dag 6 efter stroken. De fick kompletterande bete på dag 7. De började dra autonomt på den 8:e dagen efter stroken. När djuren återigen kom i kontakt med armering för dragförsök upphörde kompletterande bete eller formning och data efter stroke samlades in. Hanarna drog inte tillräckligt på dag 8 för fullständig analys av de mer komplexa beroende variablerna (dygnsrytmmått och paus efter matchen), så de fick fortsätta att dra på den 9:e, 10:e och 11:e dagen enligt samma kriterium. Den 8:e, 10:e och 11:e dagen var hela dagar. Den första dagen av dragning efter slag användes för alla analyser utom den cirkadiska analysen och analysen av pauser mellan anfallen; För denna analys användes en dag för kvinnor och tre hela dagar för män. För analys efter stroke gav de två honråttorna 55 och 844 drag på en dag, och de tre hanråttorna gav 536, 153 och 190 drag på tre dagar.
Data organiserades efter drag och matcher. För att undvika att registrera skakningar som uppstår från själva utrustningen mättes dragen med hjälp av en tröskel på 5 g med en hysteres på +/- 1 g. Ett drag registrerades när djuret utövade ett tryck över 6 g och stoppades när handtaget registrerade en kraft under 4 g. Djuren tenderade att dra i omgångar av flera snabba drag. När ett enskilt drag nådde 120 g levererades förstärkning. En match ansågs vara ett kluster av drag vars toppar alla var separerade med mindre än 1 s. Detta tröskelvärde valdes baserat på tidigare data, som indikerade att ett intertoppintervallkluster under 1 s utvecklades naturligt, och andra intertoppintervall var tillförlitligt mycket längre. Råttor drog i allmänhet många gånger i rad innan de besökte mataren, även när tidigare drag i matchen aktiverade mataren.
Totalt analyserades 7 beroende variabler. Ett parat t-test utfördes mellan baslinjemedelvärden och mätningar efter stroke, som rapporteras i figur 1, figur 2 och figur 3. Dessa siffror visar också data för enskilda djur för att ge ett intryck av variationen mellan dagar och mellan individer för varje mått som kan förväntas.
Figur 1 visar prestation före och efter stroke längs flera prestationsmått som är typiska för bedömningar av kompetensräckvidd 7,8,10. Alla data efter stroke aggregerades till en enda datapunkt, även om det tog flera dagar att samla in tillräckligt med studier. Protokollet och det automatiserade självinitierade systemet bedömde framgångsrikt framgångsfrekvensen per slag, genomsnittlig kraft per drag och drag per slag, som alla visade känslighet för slaget med varierande grad av statistisk signifikans.
Figur 2 visar två nya variabler som uppstår från kolonibur-ORT-upplägget: sessionsinitieringar och kumulativ sessionslängd. Överraskande nog påverkade stroke inte initiering av sessioner. Kvinnor initierade sessioner mer än män både före och efter stroke, men ingen av dem ändrade sin frekvens efter stroke. Omvänt ökade varaktigheten som tillbringades i kammaren för de flesta råttor, kanske på grund av den minskade framgångsfrekvensen för anfall (vilket resulterar i en minskad belöningsfrekvens)
Sessionens initiering (som representerar ett val mellan berikning och sociala belöningar som finns tillgängliga i koloniburen och matförstärkning) och varaktigheten av tiden i kammaren (i fallet med en betingad platspreferens med värdet av belöning) kan också tas som indikatorer för motivation 24,25,26,27. Ytterligare motivationsbaserade mått inkluderades, såsom "ansträngning" kvantifierad som drag per session minut28 och pauser mellan anfall29, vilket kan ses i figur 3. Dessa variabler påverkades av stroke. Som förväntat minskade antalet drag per sessionsminut och längden på pauserna mellan anfallen ökade. Förändringarna i det senare måttet var dock komplexa. Fördelningen av pauser i matchen verkade bli mer kaotisk, inklusive fler långa pauser, några mycket långa pauser och fler korta pauser också. Detta kan tyda på ett haveri i den ursprungliga skickliga motorenheten; Om så är fallet kan det vara ett lätt mätbart index för detsamma.
Trots den lilla gruppstorleken genomfördes en undersökning för att avgöra om någon av de uppmätta variablerna uppvisade korrelationer med framgångsfrekvensen, vilket potentiellt antyder deras funktionella betydelse. Shapiro Wilk-tester utfördes för att bedöma för lika fördelningar av data för variablerna success rate, mean peak pull, match per minut, kumulativ sessionslängd, pauser mellan matcher och drag per match. Shapiro Wilk-testet indikerade att fördelningen av vissa variabler avvek signifikant från normaliteten. Därför utfördes Spearmans rangordningskorrelationer för att bestämma förhållandet mellan framgångsfrekvensen före eller efter slaget och följande variabler: genomsnittlig topp, draganfall per minut, kumulativ sessionslängd, pauser mellan anfall och drag per anfall. Inga andra variabler före slaget, förutom genomsnittlig dragkraft, var meningsfullt korrelerade med framgångsfrekvensen (se tabell 1). Efter stroke visade de flesta variablerna inte heller någon meningsfull korrelation med framgångsfrekvensen, förutom genomsnittlig dragkraft (Tabell 1).
Slutligen tillåter ORT en analys inte bara av skickligt motoriskt beteende, utan också av den cirkadiska mönstringen. Figur 4 visar andelen av varje timme för varje bur där ORT var upptagen, presenterat som ett genomsnitt över baslinjen och efter strokedagar. Den blå linjen i figuren visar ett genomsnittligt antal inmatningar per timme som görs under dagen. Före stroke ägnade sig djuren åt den skickliga uppgiften på höga nivåer på morgonen, vilket minskade deras varaktighet under dagen. Några timmar innan lamporna tändes ökade engagemanget antingen igen (kvinnor) eller ökade mycket lite (män) innan det avbröts strax efter att lamporna tändes. Denna bimodala dygnsrytm förändrades helt efter stroke. Djuren ägnade sig mindre på morgnarna, och deras tid i kammaren nådde sin topp senare på dagen. Sådana mönster kan återspegla den allmänna sömnen och de cirkadiska störningar som ofta observeras efter stroke 30,31,32,33.
Figur 1: Mätning av de typiska prestationsförändringarna i skicklig räckvidd efter stroke med hjälp av ORT-proceduren. Prestationen av skicklig räckvidd före och efter stroke mättes. Dagliga medelvärden per djur för framgångsfrekvens per slag, genomsnittlig kraft per drag och antal drag per anfall visas över 5 dagar av baslinjen och en dag efter stroke (vänster) och mellan ett genomsnitt av baslinjen och en dag efter stroke (efter stroke) med rapporterade parade t-tester. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Olika självinitierade sessionsparametrar visar olika tendenser till förändring efter stroke. Måtten på självinitiering för skickliga sessioner av räckviddsbeteende före och efter stroke möjliggjordes av ORT-proceduren. Dagliga medelvärden per djur för initierade sessioner och kumulativa dagliga sessionslängder visas över 5 dagar av baslinjen och en dag efter stroke (vänster) och mellan ett genomsnitt av baslinjen och en dag efter stroke (post-stroke) med rapporterade parade t-tester. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Motivationsrelaterade variabler förändras efter stroke. Prestationsmåtten för färdighetsfärdighetsbeteendesessioner före och efter stroke relaterade till motivation bestämdes. Dagliga medelvärden per djur för paustid mellan anfall och daglig frekvens av anfall per sessionsminut visas över 5 dagar av baslinjen och en dag efter stroke (vänster) och mellan ett genomsnitt av baslinjen och en dag efter stroke (efter stroke) med rapporterade parade t-tester. Pauserna mellan anfallen förändrades i termer av dessa dagliga genomsnitt, men ännu mer slående var att fördelningen av individuella pauslängder efter slag också förändrades på båda sidor av genomsnittet. Individuella pauslängder slås samman för alla djur och visas som fördelningar på en logaritmisk axel (längst till höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Cirkadiska mönster av självinitierade sessioner förändras efter stroke. Måtten på cirkadiska mönster av självinitierade sessioner av skickligt räckviddsbeteende före (vänster) och efter (höger) stroke för alla djur, honor och hanar bestämdes. Dessa data inkluderar alla ingångar och alla tider för kammarbeläggning per bur, i genomsnitt över dagar före och efter stroke. De två burarna beräknas sedan som medelvärde igen för att visa den totala fördelningen (översta raden). Mönstren före stroke inkluderade högt engagemang på morgonen, som minskade under hela den vakna perioden med en ny topp strax före sömnfasen. Mönster efter stroke visar att sessionernas längd ökar under dagen och når sin topp före sömnfasen. Råttorna körde på omvända ljuscyklar i sitt vardagsrum. Perioden med tända lampor visas skuggad i grått för att indikera råttans normala inaktiva period. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Korrelationer | ||||||
| Variabler | Variabel för jämförelse | Spjutman | ||||
| n | Före Stroke rs | p | Efter Stroke rs | p | ||
| Genomsnittlig dragkraft | Framgång Frekvens | 5 | 1 | <0.001 | -0.975 | 0.005 |
| Dragskjutning per minut | Framgång Frekvens | 5 | 0.3 | 0.624 | -0.154 | 0.805 |
| Kumulativ sessionslängd | Framgång Frekvens | 5 | -0.1 | 0.873 | 0.564 | 0.322 |
| Pauser mellan anfallen | Framgång Frekvens | 5 | -0.6 | 0.285 | 0.205 | 0.741 |
| Drag per match | Framgång Frekvens | 5 | 0.1 | 0.873 | -0.821 | 0.089 |
Tabell 1: Spearmans korrelationskoefficienter mellan variabler. Spearmans rangordningskorrelationer utfördes för att bestämma förhållandet mellan framgångsfrekvensen före eller efter slaget och följande variabler bestämdes: genomsnittlig topp, dragmatch per minut, kumulativ sessionslängd, pauser mellan anfall och drag per slag. Före korrelationen utfördes Shapiro Wilk-tester för att bedöma för lika fördelningar av alla testvariablers framgångsfrekvens, och indikerade att vissa variabler avvek signifikant från normaliteten. Inga andra variabler före slaget än genomsnittlig dragkraft var meningsfullt korrelerade med framgångsfrekvens. Denna tabell visar resultaten av Spearmans korrelationskoefficienter (ρ) bedömda om det fanns ett samband mellan framgångsfrekvens och fem testvariabler.
Tilläggsfil 1: Steg för att bygga ORT. Instruktioner för att skriva ut och konstruera en "One Rat Turnstile". Inkluderat i instruktionerna är en lista över allt material som behövs samt steg-för-steg-instruktioner (med bilder). Filen innehåller också instruktioner för att fästa en mikrobrytare för att registrera in- och utgångar, samt kabeldragning och programmering för att ansluta en RFID-läsare. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: Detta inkluderar alla komponenter som behövs för att 3D-printa "One Rat Turnstile". Den här filen kan antingen användas direkt eller nås med hjälp av instruktionerna i Tilläggsfil 1. Alla komponenter i den här filen måste skalas med hjälp av den "linjal" som ingår (se Tilläggsfil 1 för mer information). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll har flera användningsområden. Först, och mest allmänt, utvecklades ORT i syfte att möjliggöra automatiserad beteendeträning och datainsamling inom ramen för socialt, berikat boende. Även om denna studie testade idén om att samla in typiska beteendemått och utveckla dem i samband med stroke, kan samma sak göras för andra tillämpningar och beteendeuppgifter. Även de åtgärder som samlas in i denna validering kan också justeras efter behov för att inkludera alternativa förstärkningsscheman, alternativa beteenden etc. För det andra utvärderade denna studie systemets förmåga att samla in data relaterad till försämringen av skicklig räckvidd efter en stroke. Det nuvarande protokollet har tidigare validerats för inlärning och mätning av grundläggande spaktryckning16. Aktuella data visar att det är ett giltigt tillvägagångssätt för att samla in data om strokerelaterade motoriska brister, och att åtgärder som är typiska för traditionella bedömningar av kompetensräckvidd samt nya mått är möjliga. Vid felsökning av ORT-systemet i koloniburen var en stor fråga om djuren själva skulle initiera beteendesessioner med tillräcklig frekvens, och om de skulle göra det i olika experimentella sammanhang, särskilt efter stroke. Det upptäcktes att alla eller nästan alla djur kan uppmuntras att delta tillräckligt i enkla operanta procedurer och nu för beteendetestning efter stroke. Perioder efter stroke krävde en del manuell formning, men djuren återgick snabbt till att engagera sig i beteendeuppgiften utan att försöksledaren var närvarande.
Under felsökningen upptäcktes flera procedurpunkter som ökar sannolikheten för framgång, och dessa har integrerats i protokollet. Dessa inkluderade behovet av att skala ORT efter råttans storlek och att säkerställa att djuren är lika stora och uppfödda i ett socialt sammanhang. Dessutom upptäcktes det att en enda ORT är den mest effektiva för att rymma 4-6 råttor på grund av potentiellt hög konkurrens om kammaren. Det är värt att notera att denna konkurrens inte verkar framkalla större stress jämfört med traditionella metoder; Ett tidigare experiment registrerade minskade kortisolnivåer i kolonins buruppställning i motsats till traditionell beteendetestning16. Dessutom visade det sig att för skygga djur hjälper det att ta bort vändkorset eller lämna det olåst under den inledande träningsfasen för att låta flera råttor utforska kammaren tillsammans.
Även om detta tillvägagångssätt är effektivt för att bedöma motoriska brister efter stroke, är det viktigt att erkänna några begränsningar. För det första kan det hända att djur efter stroke inte omedelbart återupptar dragandet och kan behöva några sessioner av manuell formning och/eller bete. Med detta och andra specifika metoder kan det vara svårare att automatisera träning och testning fullt ut. Detta är dock inte en begränsning som är unik för ORT-koloniburar, och djur i beteendesessioner initierade av försöksledare har ofta samma problem.
En annan begränsning är möjligheten att använda kamrarna för annat än det avsedda ändamålet. Anekdotiskt observerades flera fall där djur gick in i beteendekamrarna och tillbringade en betydande mängd tid inuti utan att aktivt delta i beteendeuppgiften. Detta hände ibland med alla djur, men särskilt med hanarna. Detta kan helt enkelt ha berott på att ORT gav lite avskildhet för djur när de inte ville engagera sig socialt. Att lägga till "ensamma" rum i koloniburen med hjälp av andra ORTs mildrar dock detta problem.
Det observerades också att djur ibland stannade i tunneln med ORT halvöppen och stannade där under perioder. Detta är anledningen till att det är bäst att ha RFID-läsaren nära beteendekammaren så att djuret inte registreras förrän de kommer in helt. Det kan spekuleras i att det är trevligt att dröja kvar i ORT på samma sätt som en klämränna. I vilket fall som helst dröjer sig djuren inte kvar där på ett sätt som skulle förhindra datainsamling, särskilt när det finns alternativa isoleringskammare som är anslutna till ORT.
En annan begränsning är att självinitierad session kan vara svårare att utjämna beteendemässig sessionstid eller beteendemässiga responsmöjligheter mellan individer i grupper. Denna begränsning kan vara särskilt relevant för strokerelaterade studier, med tanke på relationen mellan kumulativ träningstid och återhämtning. Denna begränsning kan dock åtminstone delvis åtgärdas. Om ett experiment kräver det är det möjligt att programmera många beteendeapparater för att avsluta sessioner när en målvaraktighet eller målantal svar uppnås (dvs. genom att avsluta belöningar eller dra tillbaka manipulandum). Denna lösning tar inte itu med eventuella tendenser för individer att inte nå sina mål. Men återigen, den begränsningen är inte unik för den här konfigurationen.
Detta upplägg har också en fördel att beteendeträning eller exponering kan ske under hela dagen snarare än vid några få begränsade tider. Detta kan vara användbart i flera sammanhang; Specifikt vid stroke kan det användas för att undersöka doseringseffekten av beteendemässiga rehabiliteringsmetoder.
Slutligen kan ORT sannolikt inte användas för motbjudande procedurer som socialt nederlag, påtvingad simning, betingad rädsla, etc. ORT kräver att beteendeparadigmet är aptitretande; Annars är det troligt att djuren helt enkelt undviker beteendekamrarna.
Trots begränsningar ger denna procedur betydande fördelar till de för närvarande tillgängliga beteendeparadigmen för råttor. För det första möjliggör konfigurationen kontinuerlig datainsamling med högt dataflöde samtidigt som experimentatorns tid frigörs. Även om det är viktigt att kontinuerligt övervaka utrustningen och djuren, behöver försöksledarna bara vara närvarande under korta perioder under dagen. Att köra beteendesessioner för 8 djur skulle ha krävt 4-10 timmars dagliga sessioner med det traditionella tillvägagångssättet. Tillvägagångssättet med ORT-koloniburar minskar inte bara den tiden till praktiskt taget noll (förutsatt att det finns en fungerande och automatiserad apparat), utan tillåter också datainsamling under helger med litet behov av ytterligare närvaro; En sådan fortsatt tillgång till beteendemässiga aktiviteter under helgerna ökar också den totala berikningen som är tillgänglig för djuren.
ORT-colony cage-protokollet ger datafördelar såväl som logistiska fördelar. Det finns många beroende variabler som inte är traditionellt möjliga, inklusive tempo, varaktighet eller andra parametrar för självinitierade sessioner som de som utforskas här. Cirkadiska variabler mäts ofta med hjälp av löpande hjul; Detta protokoll gör det dock möjligt att titta på mönster samt valparametrar i andra typer av beteenden. ORT kan till och med användas för att koppla samman koloniburar och ge visuell eller olfaktorisk tillgång till det motsatta könet, vilket gör det möjligt att inte bara bedöma motivation utan även cirkadiska mönster av partnerjakt. Denna studie har karakteriserat flera nya beroende variabler som kan vara användbara inom strokeforskning, inklusive cirkadiska variabler och initieringsrelaterade variabler som kan hjälpa till att utforska translationella frågor relaterade till eller i samband med förlust av motivation och depression som kan uppstå efter stroke34,35. Även om de inte tas upp här, bör andra viktiga strokerelevanta variabler, som kvalitativa analyser av räckviddskinematik, också vara lätta att adressera med detta ORT-koloniburprotokoll via rörelseaktiverade kameror.
Slutligen är en betydande fördel med detta protokoll dess förmåga att tillåta djur att stanna kvar i stora, berikade och sociala miljöer under större delen av sina liv. Framsteg när det gäller djurens välbefinnande är viktiga i grundlaboratorier, inte bara av etiska skäl utan även av vetenskapliga skäl. Djur som kan röra sig och umgås bör fungera som bättre modeller för sjukdomstillstånd som inte naturligt innebär begränsning eller berövande. Dessutom innebär den självförsörjande karaktären hos beteendesessionerna i detta protokoll att människor inte behöver vara närvarande när beteendedata samlas in. Närvaron av människor i ett laboratorium kan påverka beteendedata, ibland på olika sätt beroende på människan i fråga, hur väl de är tränade och hur de hanterar djur 2,19. Sådan okontrollerad och varierande påverkan på data kan minimeras med det aktuella protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades delvis av Beatrice H. Barrett Endowment for Research on Neuro-operant Relations vid University of North Texas (UNT). Vi är tacksamma för input och hjälp från alla medlemmar i Neuroplasticity and Repair Laboratory, särskilt Valerie Rojas, Mary Kate Moore, Cameron Scallon och Hannah McGee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Consult with local makerspace | ||
| bolt | Boltdepot | 1346 | 6-32 or 8-32 by 0.5" |
| bolt | Boltdepot | 1348 | 6-32 or 8-32 by 0.75" |
| door hinge | XJS (Amazon) | 43398-16234 | 1" cabinet stainless steel door hinge set; Optional (if "perfect hinge" is not printed) |
| drill | Any electric drill works | ||
| extension spring | Nieko (Amazon) | 50456A | Choose and adjust spring based on ORT sized and desired tension |
| granulated sugar | |||
| lock nuts | Boltdepot | 2551 | 6-32 or 8-32 |
| measuring tape | |||
| microcontroller | Arduino | A000066 | Arduino Uno |
| microswitch | Sparkfun | KW4-Z5F | mini microswitch (SPDT-roller lever) |
| One Rat Turnstile (ORT) | Vulintus | Contact company to request quote if not self-assembling | |
| Operant Chambers as desired for behavioral assessment: For this experiment we used automated isometric pull chambers from Vulintus | Vulintus | No cat #: contact Vulintus | Contact Vulintus for quote |
| PLA filament | OVERTURE (Amazon) | UK-MATTEPLA17511 | |
| plexiglass | Lesnlok (Amazon) | B09P74K7BR | clear, 1/8" thickness, Cut to size |
| plexiglass cutter | |||
| python program | Python Software Foundation | software available on request | |
| RFID reader | Priority 1 Design | RFIDRW-E-USB | With antenna |
| RFID tag | Unified Information Devices | UC-1485-10 | |
| rod | Boltdepot | 23632 | cut to > 3.5" |
| Rotary tool | Used to bore hole in apparatus and colony caging for ORT; any hardware usable | ||
| sand paper | HSYMQ (Amazon) | TOMPOL-1118-1915-11 | |
| socket wrench set | Any socket wrench set works | ||
| soldering iron | |||
| super glue | 234790 | ||
| wire | Plusivo (Amazon) | EAN0721248989789 |
References
- Whishaw, I. Q., Kolb, B. The behavior of the laboratory rat: A handbook with tests. , Oxford university press. (2004).
- Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
- Ottesen, J. L., Weber, A., Gürtler, H., Mikkelsen, L. F. New housing conditions: Improving the welfare of experimental animals. Alternatives to Laboratory Animals. 32 (Suppl 1B), 397-404 (2004).
- Arakawa, H. Ethological approach to social isolation effects in behavioral studies of laboratory rodents. Behavioural Brain Research. 341, 98-108 (2018).
- Simpson, J., Kelly, J. P. The impact of environmental enrichment in laboratory rats-behavioural and neurochemical aspects. Behavioural Brain Research. 222 (1), 246-264 (2011).
- Van Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H.
- Hays, S. A., et al. The isometric pull task: A novel automated method for quantifying forelimb force generation in rats. Journal of Neuroscience Methods. 212 (2), 329-337 (2013).
- Wong, C. C., Ramanathan, D. S., Gulati, T., Won, S. J., Ganguly, K. An automated behavioral box to assess forelimb function in rats. Journal of Neuroscience Methods. 246, 30-37 (2015).
- Sindhurakar, A., Butensky, S. D., Carmel, J. B. Automated forelimb tasks for rodents: Current advantages and limitations, and future promise. Neurorehabilitation and Neural Repair. 33 (7), 503-512 (2019).
- Sindhurakar, A., et al. An automated test of rat forelimb supination quantifies motor function loss and recovery after corticospinal injury. Neurorehabilitation and Neural Repair. 31 (2), 122-132 (2017).
- Gallistel, C., et al. Screening for learning and memory mutations: A new approach. Acta psychologica Sinica. 42 (1), 138 (2010).
- Fenrich, K. K., et al. Improved single pellet grasping using automated ad libitum full-time training robot. Behavioural Brain Research. 281, 137-148 (2015).
- Brenneis, C., et al. Automated tracking of motion and body weight for objective monitoring of rats in colony housing. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 18-31 (2017).
- Pereira, T. D., et al. Sleap: A deep learning system for multi-animal pose tracking. Nature Methods. 19 (4), 486-495 (2022).
- Lauer, J., et al. Multi-animal pose estimation, identification and tracking with deeplabcut. Nature Methods. 19 (4), 496-504 (2022).
- Butcher, G., et al. An apparatus for automatically training and collecting individualized behavioral data with socially housed rodents. Journal of Neuroscience Methods. 365, 109387 (2022).
- Winter, Y., Schaefers, A. T. A sorting system with automated gates permits individual operant experiments with mice from a social home cage. Journal of Neuroscience Methods. 196 (2), 276-280 (2011).
- Rivalan, M., Munawar, H., Fuchs, A., Winter, Y. An automated, experimenter-free method for the standardised, operant cognitive testing of rats. PLOS One. 12 (1), e0169476 (2017).
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936-946 (2006).
- Lang, C. E., Lohse, K. R., Birkenmeier, R. L. Dose and timing in neurorehabilitation: Prescribing motor therapy after stroke. Current Opinion in Neurology. 28 (6), 549 (2015).
- Inventing a supercage for rats. Butcher, G., Becker, A., Davidson, A., Baltazar, M., Armshaw, J., Cruz, S. Poster presentation at Association for Behavior Analysis International Conference, Chicago, IL, , (2019).
- Engineering an enriched environment operant chamber and its implications. Davidson, A., et al. Poster Presented at the Texas Association for Behavior Analysis Annual Conference, , Worth, TX. (2019).
- Windle, V., et al. An analysis of four different methods of producing focal cerebral ischemia with endothelin-1 in the rat. Experimental Neurology. 201 (2), 324-334 (2006).
- Reppucci, C. J., Veenema, A. H. The social versus food preference test: A behavioral paradigm for studying competing motivated behaviors in rodents. MethodsX. 7, 101119 (2020).
- Borland, J. M., et al. A novel operant task to assess social reward and motivation in rodents. Journal of Neuroscience Methods. 287, 80-88 (2017).
- Tzschentke, T. M. Review on cpp: Measuring reward with the conditioned place preference (cpp) paradigm: Update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), 227-462 (2007).
- Salamone, J. D., Correa, M. Neurobiology and pharmacology of activational and effort-related aspects of motivation: Rodent studies. Current Opinion in Behavioral Sciences. 22, 114-120 (2018).
- Shull, R. L. Bouts, changeovers, and units of operant behavior. European Journal of Behavior Analysis. 12 (1), 49-72 (2011).
- Gottlieb, E., et al. The bidirectional impact of sleep and circadian rhythm dysfunction in human ischaemic stroke: A systematic review. Sleep Medicine Reviews. 45, 54-69 (2019).
- Lo, E. H., et al.
- Meng, H., Liu, T., Borjigin, J., Wang, M. M. Ischemic stroke destabilizes circadian rhythms. Journal of Circadian Rhythms. 6 (1), 1-13 (2008).
- Stern, R. A., Bachman, D. L.
- Rapolienė, J., Endzelytė, E., Jasevičienė, I., Savickas, R. Stroke patients motivation influence on the effectiveness of occupational therapy. Rehabilitation Research and Practice. 2018, (2018).
- Robinson, R. G., Jorge, R. E.
- Faraji, J., et al. Sex-specific stress and biobehavioral responses to human experimenters in rats. Frontiers in Neuroscience. 16, 965500 (2022).
