Effektiv PAM-mindre baseredigering for sebrafiskmodellering av menneskelig genetisk sykdom med zSpRY-ABE8e
Summary
Denne protokollen beskriver hvordan man utfører effektiv adeninbaseredigering uten PAM-begrensning for å konstruere en presis sebrafisksykdomsmodell ved bruk av zSpRY-ABE8e.
Abstract
CRISPR / Cas9-teknologi har økt verdien av sebrafisk for modellering av humane genetiske sykdommer, studier av sykdomspatogenese og legemiddelscreening, men begrensninger i protospacer tilstøtende motiv (PAM) er et stort hinder for å skape nøyaktige dyremodeller av humane genetiske lidelser forårsaket av enkeltnukleotidvarianter (SNV). Til nå har noen SpCas9-varianter med bred PAM-kompatibilitet vist effektivitet i sebrafisk. Anvendelsen av den optimaliserte SpRY-medierte adeninbaseeditoren (ABE), zSpRY-ABE8e og syntetisk modifisert gRNA i sebrafisk har muliggjort effektiv adenin-guaninbasekonvertering uten PAM-begrensning. Beskrevet her er en protokoll for effektiv adeninbaseredigering uten PAM-begrensning i sebrafisk ved bruk av zSpRY-ABE8e. Ved å injisere en blanding av zSpRY-ABE8e mRNA og syntetisk modifisert gRNA i sebrafiskembryoer, ble en sebrafisksykdomsmodell konstruert med en presis mutasjon som simulerte et patogent sted for TSR2-ribosommodningsfaktoren (tsr2). Denne metoden gir et verdifullt verktøy for etablering av nøyaktige sykdomsmodeller for å studere sykdomsmekanismer og behandlinger.
Introduction
Enkeltnukleotidvarianter (SNV) som forårsaker missense eller nonsensemutasjoner er den vanligste kilden til mutasjoner i det menneskelige genom1. For å avgjøre om en bestemt SNV er patogen, og for å kaste lys over patogenesen, kreves presise dyremodeller2. Sebrafisk er gode sykdomsmodeller for mennesker, med høy grad av fysiologisk og genetisk homologi hos mennesker, kort utviklingssyklus og sterk reproduksjonsevne, noe som er fordelaktig for forskning på sykdomsfremkallende egenskaper og mekanismer, samt medikamentscreening3.
Det grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas9-systemet har blitt mye brukt i genomredigering av forskjellige arter, inkludert sebrafisk4. Med gRNA-veiledning kan CRISPR/Cas9-systemet generere DNA-dobbeltstrengede brudd (DSB) på målstedet, som deretter tillater enkeltbasesubstitusjon gjennom rekombinasjon av målstedet med donor-DNA-maler via HDR-banen (homology-directed repair). Imidlertid er effektiviteten til denne baseerstatningsmetoden ganske lav, da den cellulære DNA-reparasjonsprosessen hovedsakelig utføres av den ikke-homologe endekoblingsveien (NHEJ), som vanligvis ledsages av innsetting og sletting (indel) mutasjoner5. Heldigvis lindrer CRISPR/Cas9-basert enkeltbaseredigeringsteknologi dette problemet betydelig ved å bruke basisredigerere, som muliggjør mer effektiv enkeltbaseredigering uten å indusere DSB-er. To hovedklasser av basisredaktører, adeninbaseredaktører (ABE) og cytosinbaseredaktører (CBE), er utviklet for å implementere redigering av basesubstitusjon for A· T til G · C og C·G til T· A, henholdsvis 6,7,8,9,10,11. Disse fire typene basesubstitusjoner dekker 30% av humanpatogene varianter12. Begge klasser av baseredaktører, inkludert PmCDA1, BE-system, CBE4max, ABE7.10 og ABE8e, har blitt rapportert å fungere i sebrafisk, med BE4max og ABE8e spesielt rapportert å oppnå høy redigeringsaktivitet 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-proteiner fra forskjellige arter, inkludert Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes og S. canis, har blitt implementert i sebrafiskgenredigering, med Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) som brukes mest20,21,22,23. SpCas9 kan imidlertid bare gjenkjenne målsteder med et NGG-protospacer tilstøtende motiv (PAM), noe som begrenser det redigerbare området og kan føre til at ingen passende sekvens blir funnet nær det patogene stedet av interesse24. For å utvide målområdet har en rekke SpCas9-varianter blitt konstruert for å gjenkjenne forskjellige PAM-er gjennom rettet evolusjon og strukturstyrt design. Imidlertid er få varianter effektive hos dyr, spesielt i sebrafisk, noe som begrenser anvendelsen av sebrafisk i SNV-relatert sykdomsforskning25,26,27,28. Nylig har to varianter av SpCas9, SpG og SpRY, med mindre strenge PAM-restriksjoner (NGN for SpG og NNN for SpRY med høyere preferanse for NRN enn NYN) blitt rapportert å vise høy redigeringsaktivitet i humane celler og planter 29,30,31,32. Deretter har SpG og SpRY, samt en rekke av deres medierte baseredaktører, som SpRY-medierte CBEer og SpRY-medierte ABEer, også blitt rapportert å fungere i sebrafisk, noe som vil forbedre anvendelsen av sebrafiskmodeller i den mekanistiske studien og legemiddelscreening av SNV-relaterte sykdommer 18,33,34,35. Videre ble i-Silence foreslått som en effektiv og nøyaktig gen-knockout-strategi gjennom ABE-mediert startkodonkonvertering fra ATG til GTG eller ACG36. Kombinasjonen av i-Silence-strategien og den SpRY-medierte baseeditoren zSpRY-ABE8e gir en ny metode for sykdomsmodellering18. Denne protokollen demonstrerer hvordan man utfører genredigering ved hjelp av zSpRY-ABE8e i sebrafisk for å konstruere en tsr2 (M1V) modell ved hjelp av i-Silence-strategien. Redigeringseffektiviteten og fenotypene som vises i sebrafiskmodeller ble vurdert og analysert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver konstruksjonen av en sebrafisksykdomsmodell ved hjelp av baseeditoren zSpRY-ABE8e. Sammenlignet med den tradisjonelle HDR-banen for basesubstitusjon, kan denne protokollen oppnå mer effektiv baseredigering og redusere forekomsten av indels. Samtidig innebærer denne protokollen å implementere den nylig foreslåtte i-Silence gen-knockout-strategien i sebrafisk. Til sammen vil zSpRY-ABE8e forbedre anvendelsen av sebrafiskmodeller i sykdomsforskning.
Off-target-effek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Barbara Garbers, PhD, fra Liwen Bianji (Edanz) for å redigere den engelske teksten til et utkast til dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Key-Area Research and Development Program of Guangdong Province (2019B030335001), National Key R &D Program of China (2019YFE0106700), National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782), og Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
References
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
