Summary
该协议描述了如何在没有PAM限制的情况下进行有效的腺嘌呤碱基编辑,以使用zSpRY-ABE8e构建精确的斑马鱼疾病模型。
Abstract
CRISPR/Cas9技术增加了斑马鱼在模拟人类遗传疾病、研究疾病发病机制和药物筛选方面的价值,但原间隔邻基序(PAM)的限制是创建由单核苷酸变异(SNV)引起的人类遗传疾病的准确动物模型的主要障碍。到目前为止,一些具有广泛PAM兼容性的SpCas9变体已经在斑马鱼中显示出效率。优化的SpRY介导的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)、zSpRY-ABE8e和合成修饰的gRNA在斑马鱼中的应用实现了高效的腺嘌呤-鸟嘌呤碱基转化,不受PAM限制。这里描述的是一种使用zSpRY-ABE8e在斑马鱼中进行高效腺嘌呤碱基编辑的协议,而没有PAM限制。通过将zSpRY-ABE8e mRNA和合成修饰的gRNA的混合物注入斑马鱼胚胎中,构建了具有精确突变的斑马鱼疾病模型,该模型模拟了TSR2核糖体成熟因子(tsr2)的致病位点。该方法为建立准确的疾病模型以研究疾病机制和治疗方法提供了有价值的工具。
Introduction
引起错义或无义突变的单核苷酸变异(SNV)是人类基因组中最常见的突变来源1。为了确定特定的SNV是否具有致病性,并阐明其发病机制,需要精确的动物模型2。斑马鱼是良好的人类疾病模型,表现出与人类生理和遗传同源性高、发育周期短、繁殖能力强等特点和机制研究,有利于研究致病特征和机制,以及药物筛选3。
成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统已广泛应用于包括斑马鱼4在内的各种物种的基因组编辑。在gRNA的指导下,CRISPR/Cas9系统可以在靶位点产生DNA双链断裂(DSB),然后通过同源定向修复(HDR)途径将靶位点与供体DNA模板重组,从而实现单碱基替换。然而,这种碱基置换方法的效率相当低,因为细胞DNA修复过程主要由非同源末端连接(NHEJ)途径进行,该途径通常伴随着插入和缺失(indel)突变5。幸运的是,基于CRISPR/Cas9的单碱基编辑技术通过使用碱基编辑器显着缓解了这个问题,可以在不诱导DSB的情况下实现更高效的单碱基编辑。已经开发了两大类碱基编辑器,腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)和胞嘧啶碱基编辑器(CBE),以实现A·T到G·C和C·G到T·A,分别为6,7,8,9,10,11。这四种碱基取代覆盖了30%的人类致病变异12。据报道,这两类碱基编辑器,包括PmCDA1,BE系统,CBE4max,ABE7.10和ABE8e,在斑马鱼中工作,特别是BE4max和ABE8e实现了高编辑活性13,14,15,16,17,18,19。
来自不同物种的Cas9蛋白,包括金黄色葡萄球菌,化脓性链球菌和犬链球菌,已经在斑马鱼基因编辑中实施,其中化脓性链球菌Cas9(SpCas9)应用最广泛20,21,22,23。然而,SpCas9只能识别具有NGG原间隔相邻基序(PAM)的目标位点,这限制了其可编辑范围,并可能导致在感兴趣的致病位点附近找不到合适的序列24。为了扩大靶标范围,已经设计了各种SpCas9变体,以通过定向进化和结构引导设计来识别不同的PAM。然而,很少有变异在动物中有效,特别是在斑马鱼中,这限制了斑马鱼在SNV相关疾病研究中的应用25,26,27,28。最近,据报道,SpCas9的两个变体SpG和SpRY,具有不太严格的PAM限制(用于SpG的NGN和用于SpRY的NNN,对NRN的偏好高于NYN)在人类细胞和植物中表现出高编辑活性29,30,31,32。随后,SpG和SpRY以及它们介导的一些碱基编辑器,如SpRY介导的CBE和SpRY介导的ABE,也被报道在斑马鱼中起作用,这将加强斑马鱼模型在SNV相关疾病的机制研究和药物筛选中的应用18,33,34,35.此外,i-Silence被提出作为一种有效且准确的基因敲除策略,通过ABE介导的起始密码子从ATG到GTG或ACG36的转换。i-Silence策略和SpRY介导的碱基编辑器zSpRY-ABE8e的结合为疾病建模提供了一种新方法18。该协议演示了如何在斑马鱼中使用zSpRY-ABE8e进行基因编辑,以使用i-Silence策略构建tsr2(M1V)模型。对斑马鱼模型中出现的编辑效率和表型进行了评估和分析。
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Protocol
本研究严格按照华南师范大学护理与使用委员会的指导方针进行。
1. 制备合成修饰的gRNA和zSpRY-ABE8e mRNA
- 根据先前的出版物37,38设计gRNA。
- 优先选择 NRN 作为 PAM 序列,因为 zSpRY-ABE8e 显示 NRN PAM 的偏好高于 NYN PAM(其中 R 为 A 或 G,Y 为 C 或 T)18。确保目标腺嘌呤核苷酸处于高度活跃的编辑窗口(沿原间隔体的第三至第九个核苷酸)。
- 订购两端用2′-O-甲基-3′-硫代磷酸酯(MS)修饰的EasyEdit sgRNA (EE gRNA)(图1)。
注意:EE gRNA应溶解在无RNase的水中并储存在-80°C。 - 线性化zSpRY-ABE8e质粒18。
- 用 XbaI 酶(材料表)在37°C的金属浴中线性化6μg质粒3小时。
- 根据制造商的说明,使用DNA纯化试剂盒(参见 材料表)纯化线性化质粒。
- 使用 体外 转录试剂盒转录mRNA(材料表)。
- 根据制造商的说明,使用线性化质粒作为模板转录zSpRY-ABE8e mRNA。
注意:所有涉及mRNA和gRNA的操作都需要使用不含RNase的实验室用品。
- 根据制造商的说明,使用线性化质粒作为模板转录zSpRY-ABE8e mRNA。
- 使用RNA纯化试剂盒(材料表)根据制造商的说明纯化mRNA。
注意:在洗脱之前,必须干燥乙醇以避免细胞毒性,如果不立即使用,mRNA应储存在-80°C。
2.制备显微注射玻璃毛细管
- 设置微量移液器拉拔器系统,并预热至少30分钟。
- 根据制造商的说明运行斜坡测试以确定熔化硼硅酸盐玻璃毛细管(外径为 1 毫米,内径为 0.58 毫米)所需的热值。
- 选择一个程序,然后单击键盘上的数字以输入参数值。设置以下参数以拉动玻璃毛细管:热量 = 斜坡测试值,拉力 = 50,速度 = 100,时间 = 50,压力 = 30。
- 安装毛细管,确保它在凹槽中。按 拉动启动/停止 以运行程序。
- 通过将拉动的毛细管插入包含间隙的泡沫中来保存毛细管,保持针头悬浮。
3. 将zSpRY-ABE8e mRNA和EE gRNA混合物显微注射到斑马鱼胚胎中
- 在注射前一天晚上设置繁殖池。插入一个分隔线,在每个水箱中放置两只雌性和一条雄性AB系斑马鱼(3-18个月大),并盖上盖子。有关性别区分,请参阅以前的出版物39.
注意:要获得更多胚胎,请选择至少 1 周未繁殖的鱼。 - 注射前第二天早上,在冰上解冻zSpRY-ABE8e mRNA和EE gRNA。将 mRNA 和 gRNA 混合至最终浓度分别为 400 ng/μL 和 200 ng/μL。
- 使用不含RNase的吸头和管子在冰上执行整个过程,并戴手套处理。
- 配置气动微型注射器。关闭气泵分压阀,先打开主阀,拧下气瓶,将分压阀压力调节至0.2MPa/29psi。
- 打开气动微量注射器,将模式设置为定时器,并将初始参数压力值调整为 20.0 psi,将 TIMER 值调整为 0.040 s。
- 使用细镊子在体视显微镜下小心地折断拉动的玻璃毛细管的针头,确保针头以一定角度切割,以利于绒毛膜和卵子的刺穿。
注意:针的断点需要在正确的位置,并且足够坚固以刺穿鸡蛋,但又足够薄以尽量减少对鸡蛋的损坏。 - 使用微量装载器移液器吸头将zSpRY-ABE8e mRNA和gRNA的混合物添加到玻璃毛细管的尖端,避免毛细管中出现气泡。将针头连接到显微操纵器,并配置进样器的压力和 TIMER 值,以确保使用微帽每次进样产生 2 nL 的混合物。
- 拔下养殖箱的隔板,让鱼繁殖10-15分钟。使用过滤器收集卵子,并在体视显微镜下检查卵子的细胞阶段和质量。选择单细胞状态的卵子进行注射,提高编辑效率。
- 将卵子排列在1.5%琼脂糖注射板上,并在显微镜下将2nL混合物注入胚胎的细胞中,而不是蛋黄中,以提高编辑效率。保留至少15个鸡蛋作为对照组。
- 使用1x E3缓冲液收集培养皿中的鸡蛋,并将其置于28°C的培养箱中。 取出死卵,每12小时更换一次培养缓冲液,直到受精后48小时(hpf)。
4. 使用EditR进行基础编辑的效率分析
- 在 48 hpf 下,分别将三个池的六个随机选择的注射胚胎和六个随机选择的对照胚胎收集到 PCR 管中。使用移液器吸出残留的E3缓冲液。
- 向 PCR 管中加入 40 μL 50 mM NaOH。将试管置于95°C的金属浴中20分钟,然后涡旋15秒。
- 加入 4 μL 的 1 M Tris·盐酸(pH 8.0)进入每个试管中以中和NaOH。在室温下以2,000× g 短暂离心10秒,以除去管壁上的液滴。将上清液收集到新的PCR管中,并将其储存在-20°C。
- 在gRNA靶位点的上游和下游设计合适的引物。使用1μL上述上清液作为50μL体积PCR反应的模板。本研究中用于PCR的引物列于 补充表1中。
- 进行DNA琼脂糖凝胶电泳以确保正确和特异性条带,然后如前所述进行Sanger测序40。
- 使用 EditR (1.0.10) 程序分析 Sanger 测序数据41.
- 将测序文件(ab1 格式)上传到“上传 .ab1 文件”框中。
- 在“输入gRNA序列”框中以5′-3′方向输入20 bp gRNA序列。
- 打开测序文件(ab1格式),确认20 bp gRNA序列开始和结束的碱基位置。在“5′开始”和“3′结束”框中输入相应的基本位置。
- 单击预测编辑以获得基本 编辑 效率。检查gRNA靶序列附近的测序数据质量,以避免无序峰或插入缺失。
注意:通常,通过调节PCR退火温度可以有效去除无序峰。
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Representative Results
据报道, TSR2 的突变会导致钻石黑扇贫血(DBA)42。在这里,使用i-Silence策略构建了 具有tsr2 (M1V)突变的DBA斑马鱼模型。使用zSpRY-ABE8e将斑马鱼 tsr2 起始密码子的腺嘌呤成功转化为鸟嘌呤(图3)。
对 Sanger 测序结果的 EditR 分析表明, tsr2 起始密码子的腺嘌呤碱基存在 A/G 重叠(图 4)。
在F0创始人与先前生成的 tsr2 杂合突变成虫交配后,在显微镜下观察受精后2天(dpf)的胚胎表型。与对照组相比,几个胚胎表现出较小的眼睛和肿胀的心包的表型(图5)。胚胎用0.03%三卡因麻醉,固定在4%甲基纤维素上,并拍照。
图 1:加载到 zSpRY-ABE8e 蛋白中的 EE gRNA 的序列和二级结构示意图。 化学修饰的核苷酸用黑色星星标记。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:包含密码子优化的 TadA8e (zTadA8e) 和密码子优化的 SpRYCas9 (zSpRYCas9) 的 zSpRY-ABE8e mRNA 结构示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:使用 zSpRY-ABE8e 的斑马鱼 tsr2 (M1V) 突变示意图。 PAM序列以红色突出显示,编辑过的碱基以蓝色突出显示,目标氨基酸以粗体突出显示。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:使用 zSpRY-ABE8e 的斑马鱼 tsr2 (M1V) 突变的测序色谱图结果。 x 轴表示基本序列,y 轴表示峰值高度,编辑后的底数用红色箭头表示。 请点击此处查看此图的大图。
图 5:与对照组相比,2 dpf 时 tsr2 (M1V) 胚胎的表型。 (A,C)(A,B)野生型AB斑马鱼和(C,D)tsr2(M1V)胚胎在2 dpf的侧视图和(B,D)背视图。C 中的红色箭头表示心包肿胀。红框和直径反映了眼睛的大小。比例尺:500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
补充表1:请点击此处下载此文件。
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Discussion
该协议描述了使用碱基编辑器zSpRY-ABE8e构建斑马鱼疾病模型。与传统的HDR碱基替代途径相比,该方案可以实现更高效的碱基编辑并减少插入缺失的发生。同时,该协议涉及在斑马鱼中实施最近提出的i-Silence基因敲除策略。总之,zSpRY-ABE8e将加强斑马鱼模型在疾病研究中的应用。
脱靶效应是CRISPR/Cas9系统中的常见问题。考虑到无PAM的限制,zSpRY-ABE8e的脱靶效应可能更高,即使在先前的研究中没有发现显着的脱靶效应,包括 tsr2 靶向18。幸运的是,这个问题可以通过严格的gRNA设计标准来避免,该标准确保只有一个基因组序列与gRNA与PAM完全匹配,并将预测的脱靶位点总数保持在最低限度。此外,一项研究表明,与注射 mRNA 和 gRNA43 相比,注射核糖核蛋白 (RNP) 和 gRNA 可降低脱靶概率。此外,gRNA和Cas9的修饰也可以减少脱靶效应44,45。在斑马鱼中,还可以筛选多代育种的目标表型,以获得脱靶效应低的动物模型。
该协议仍然存在一些限制。虽然zSpRY-ABE8e没有PAM限制,但它仍然表现出PAM偏好,在斑马鱼中NRN优于NYN。此外,ABE只能实现两种类型的基替换,这意味着它仅适用于部分模型的构建。仍然需要开发更多的碱基编辑器来实现斑马鱼中剩余的碱基替换。
总之,该协议为在斑马鱼中使用zSpRY-ABE8e单碱基编辑器提供了详细的指导。为构建精确的斑马鱼疾病模型提供了一种可行且有效的方法,拓展了斑马鱼模型在SNV相关疾病发病机制和治疗研究中的应用。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢来自Liwen Bianji(Edanz)的Barbara Garbers博士编辑了这份手稿草稿的英文文本。这项工作得到了广东省重点领域研究与发展计划(2019B030335001)、国家重点研发计划(2019YFE0106700)、国家自然科学基金(32070819,31970782)和广东省水产经济动物病原生物学与流行病学重点实验室研究基金计划(PBEA2020YB05)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
mMACHINE kit | |||
Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
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