Effektiv PAM-mindre basredigering för zebrafiskmodellering av mänsklig genetisk sjukdom med zSpRY-ABE8e
Summary
Detta protokoll beskriver hur man utför effektiv adeninbasredigering utan PAM-begränsning för att konstruera en exakt zebrafisksjukdomsmodell med zSpRY-ABE8e.
Abstract
CRISPR / Cas9-tekniken har ökat värdet av zebrafisk för modellering av mänskliga genetiska sjukdomar, studier av sjukdomspatogenes och läkemedelsscreening, men begränsningar av protospacer intilliggande motiv (PAM) är ett stort hinder för att skapa exakta djurmodeller av mänskliga genetiska störningar orsakade av enkelnukleotidvarianter (SNV). Hittills har vissa SpCas9-varianter med bred PAM-kompatibilitet visat effektivitet i zebrafisk. Tillämpningen av den optimerade SpRY-medierade adeninbasredigeraren (ABE), zSpRY-ABE8e och syntetiskt modifierade gRNA i zebrafisk har möjliggjort effektiv adenin-guaninbasomvandling utan PAM-begränsning. Här beskrivs ett protokoll för effektiv adeninbasredigering utan PAM-begränsning i zebrafisk med zSpRY-ABE8e. Genom att injicera en blandning av zSpRY-ABE8e mRNA och syntetiskt modifierat gRNA i zebrafiskembryon konstruerades en zebrafisksjukdomsmodell med en exakt mutation som simulerade en patogen plats för TSR2-ribosommognadsfaktorn (tsr2). Denna metod ger ett värdefullt verktyg för att etablera noggranna sjukdomsmodeller för att studera sjukdomsmekanismer och behandlingar.
Introduction
Single-nucleotide varianter (SNV) som orsakar missense eller nonsensmutationer är den vanligaste källan till mutationer i det mänskliga genomet1. För att avgöra om en viss SNV är patogen och för att belysa dess patogenes krävs exakta djurmodeller2. Zebrafiskar är bra mänskliga sjukdomsmodeller, uppvisar en hög grad av fysiologisk och genetisk homologi med människor, en kort utvecklingscykel och stark reproduktionsförmåga, vilket är fördelaktigt för forskning om patogena egenskaper och mekanismer, samt läkemedelsscreening3.
Det klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningarna (CRISPR) / Cas9-systemet har använts i stor utsträckning vid genomredigering av olika arter, inklusive zebrafisk4. Med gRNA-vägledning kan CRISPR / Cas9-systemet generera DNA-dubbelsträngade brott (DSB) på målplatsen, vilket sedan möjliggör enkelbassubstitution genom rekombination av målplatsen med donator-DNA-mallar via homologi-riktad reparationsväg (HDR). Effektiviteten hos denna basersättningsmetod är emellertid ganska låg eftersom den cellulära DNA-reparationsprocessen huvudsakligen utförs av den icke-homologa ändfogningsvägen (NHEJ), som vanligtvis åtföljs av insättnings- och deletionsmutationer (indel)5. Lyckligtvis lindrar CRISPR / Cas9-baserad redigeringsteknik med en bas avsevärt detta problem genom att använda basredigerare, vilket möjliggör effektivare redigering med en bas utan att inducera DSB. Två huvudklasser av basredigerare, adeninbasredigerare (ABE) och cytosinbasredigerare (CBE), har utvecklats för att implementera bassubstitutionsredigering för A· T till G· C och C·G till T· A, respektive 6,7,8,9,10,11. Dessa fyra typer av bassubstitutioner täcker 30% av humana patogena varianter12. Båda klasserna av basredigerare, inklusive PmCDA1, BE-system, CBE4max, ABE7.10 och ABE8e, har rapporterats fungera i zebrafisk, med BE4max och ABE8e särskilt rapporterade för att uppnå hög redigeringsaktivitet 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-proteiner från olika arter, inklusive Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes och S. canis, har implementerats i zebrafiskgenredigering, med Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) som används mest20,21,22,23. SpCas9 kan dock bara känna igen målplatser med ett NGG-protospacer-intilliggande motiv (PAM), vilket begränsar dess redigerbara intervall och kan resultera i att ingen lämplig sekvens hittas nära den patogena platsen av intresse24. För att utöka målområdet har en mängd olika SpCas9-varianter konstruerats för att känna igen olika PAMs genom riktad utveckling och strukturstyrd design. Få varianter är dock effektiva hos djur, särskilt i zebrafiskar, vilket begränsar tillämpningen av zebrafisk i SNV-relaterad sjukdomsforskning25,26,27,28. Nyligen har två varianter av SpCas9, SpG och SpRY, med mindre stränga PAM-begränsningar (NGN för SpG och NNN för SpRY med högre preferens för NRN än NYN) rapporterats uppvisa hög redigeringsaktivitet i mänskliga celler och växter 29,30,31,32. Därefter har SpG och SpRY, liksom ett antal av deras medierade basredaktörer, såsom SpRY-medierade CBE och SpRY-medierade ABE, också rapporterats arbeta i zebrafisk, vilket kommer att förbättra tillämpningen av zebrafiskmodeller i den mekanistiska studien och läkemedelsscreening av SNV-relaterade sjukdomar 18,33,34,35. Vidare föreslogs i-Silence som en effektiv och korrekt genknockoutstrategi genom ABE-medierad startkodonkonvertering från ATG till GTG eller ACG36. Kombinationen av i-Silence-strategin och den SpRY-medierade basredigeraren zSpRY-ABE8e ger en ny metod för sjukdomsmodellering18. Detta protokoll visar hur man utför genredigering med zSpRY-ABE8e i zebrafisk för att konstruera en tsr2 (M1V) modell med hjälp av i-Silence-strategin. Redigeringseffektiviteten och fenotyperna som förekommer i zebrafiskmodeller bedömdes och analyserades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver konstruktionen av en zebrafisksjukdomsmodell med hjälp av basredigeraren zSpRY-ABE8e. Jämfört med den traditionella HDR-vägen för bassubstitution kan detta protokoll uppnå effektivare basredigering och minska förekomsten av indels. Samtidigt innebär detta protokoll att implementera den nyligen föreslagna i-Silence-genknockoutstrategin i zebrafisk. Sammantaget kommer zSpRY-ABE8e att förbättra tillämpningen av zebrafiskmodeller i sjukdomsforskning.
Off-targe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Barbara Garbers, PhD, från Liwen Bianji (Edanz) för att redigera den engelska texten till ett utkast till detta manuskript. Detta arbete stöddes av Key-Area Research and Development Program i Guangdongprovinsen (2019B030335001), Kinas nationella Key R&D Program (2019YFE0106700), National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) och Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Lab of Pathogen Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
References
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
