Saplama1 aracılı peksofajinin izlenmesi
Summary
Bu protokol, canlı hücrelerde Stub1 aracılı peksofajiyi tetiklemek ve izlemek için talimatlar sağlar.
Abstract
Memeli hücreleri, Stub1 aracılı peksofaji yoluyla peroksizomları çevirebilir. Yol potansiyel olarak peroksizomların miktarının ve kalitesinin hücresel kontrolüne izin verir. Bu işlem sırasında, ısı şoku proteini 70 ve ubikitin E3 ligaz, Stub1, peksofajiyi başlatmak için döndürülecek peroksizomlar üzerine translokasyona sahiptir. Stub1 ligaz aktivitesi, ubikitin ve diğer otofaji ile ilgili modüllerin hedeflenen peroksizomlarda birikmesine izin verir. Peroksizomal lümen içindeki reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerinin yükselmesi, Stub1 aracılı peksofajiyi aktive edebilir. Bu nedenle, bu yolu tetiklemek ve izlemek için boya destekli ROS üretimi kullanılabilir. Bu makalede, memeli hücre kültürlerinde peksofajiyi başlatmak için iki sınıf boya, floresan proteinleri ve sentetik floroforlar kullanma prosedürleri özetlenmektedir. Bu boya destekli ROS üretim tabanlı protokoller, yalnızca küresel olarak bir hücre popülasyonundaki tüm peroksizomları hedeflemek için kullanılamaz, aynı zamanda tek hücreler içindeki bireysel peroksizomların manipülasyonuna da izin verebilir. Ayrıca Stub1 aracılı peksofajinin canlı hücre mikroskobu kullanılarak nasıl takip edilebileceğini de açıklıyoruz.
Introduction
Peroksizomlar, çoğu ökaryotik hücrede bulunan tek zara bağlı organellerdir. Peroksizomlar, çok uzun zincirli yağ asitlerinin, pürin katabolizmasının ve eter fosfolipid ve safra asidi sentezinin beta-oksidasyonunu gerçekleştirmek için gerekli metabolik bir bölmedir1. Peroksizom türevi asetil-CoA, metabolizmadaki merkezi sinyalizasyonu düzenleyerek lipid homeostazını kontrol eder2. Bu nedenle, tehlikeye giren peroksizomal fonksiyonların nörodejeneratif bozukluklar, yaşlanma, kanserler, obezite ve diyabet dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda ima edilmesi şaşırtıcı değildir 3,4,5. Peroksizomal operasyonun sürdürülmesinde önemli bir süreç peksofajidir. Pekzofaji, peroksizomların otofaji ile seçici devri için katabolik bir süreçtir. Hücreler, peroksizomların miktarını ve kalitesini kontrol etmeye yardımcı olmak için peksofaji kullanır, böylece uygun peroksizomal fonksiyonu sağlar. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, PEX1 peroksizomal biyogenez faktörleri 1 ve 6’daki mutasyonların neden olduğu peroksizom kaybının kontrolsüz peksofaji6’dan kaynaklandığını göstermiştir. Özellikle, tüm peroksizom biyogenez bozukluğu (PBD) hastalarının% 65’i, memeli hücrelerinde PEX1, PEX6 ve PEX26’dan oluşan peroksizomal AAA ATPaz kompleksinde eksiklikler barındırmaktadır7.
Pekzofajiyi başlatmak ve incelemek için bir dizi yöntem kullanılabilir. Mayada, sağlanan besinler peroksizoma bağımlı karbon kaynaklarından peroksizomdan bağımsız karbon kaynaklarına (hücresel peroksizom sayılarını düşürmek için) geçtiğinde peksofaji tetiklenir8. Örneğin, metanol tarafından yetiştirilen Pichia pastoris hücrelerinin metanol ortamından glikoz ortamına ve etanol ortamına transferi, sırasıyla 8,9,10 mikropeksofaji ve makropeksofajiyi indükler. Mikropeksofaji sekestörleri, vakuolün fincan benzeri vakuolar sekestrasyon membranları ve mikropekzofajiye özgü membran aparatı (MIPA) olarak adlandırılan kapak benzeri bir yapı oluşturacak şekilde yeniden şekillendirilerek peroksizomları bozunma için kümeledi. Makropeksofajide, bireysel peroksizomlar, peksofagozomlar olarak bilinen çift zarlı yapılar tarafından yutulur, ardından yıkım için vakuol ile füzyon 8,9,10 yapılır. Saccharomyces cerevisiae’deki Atg36p ve Pichia pastoris’teki Atg30p gibi peksofaji reseptörlerinin fosforilasyonu, reseptörlerin çekirdek otofaji makinelerini işe almaları ve otofagozomlara peroksizomal hedeflemeyi kolaylaştırmaları için kritik öneme sahiptir 8,11.
Memeli hücrelerinde, peksofaji ubikitinasyon ile indüklenebilir. Peroksizomal membran proteinleri PMP34 veya PEX3’ün sitozolik tarafta ubikitin ile etiketlenmesi peksofaji12’yi indükler. PEX3’ün aşırı ekspresyonu, lizozomlar13 tarafından peroksizom ubikitinasyonunu ve peroksizom eliminasyonunu indükler. Ek olarak, PEX5’in bir C-terminali EGFP ile füzyonu, monoubikitinlenmiş PEX5’in ihracatını bozar ve peksofaji14 ile sonuçlanır. Öte yandan, peksofajiH2O2tedavisi ile de tetiklenebilir. Peroksizomlar reaktif oksijen türleri (ROS) üretir; Spesifik olarak, çok uzun zincirli yağ asitlerinin (> 22 karbon) beta-oksidasyonunun ilk adımını katalize eden peroksizomal enzim Acox1, sadece asetil-CoA değil, aynı zamanda peroksizomal ROS da üretir. H2O2tedavisi altında artan ROS seviyelerine yanıtolarak, memeli hücreleri ROS üretimini azaltmak ve stresi hafifletmek için peksofajiyi aktive eder. H2O2tedavisinin ataksi-telanjiektazi mutasyona uğramış (ATM) peroksizomlara alımını yönlendirdiği bildirilmiştir. ATM daha sonra peksofaji15 ile peroksizomal ciroyu teşvik etmek için PEX5’i fosforile eder.
Peroksizomlar ROS üreten merkezler olduğundan, ROS hasarına da eğilimlidirler. ROS kaynaklı peroksizomal yaralanmalar, peroksizom kalite kontrol yollarını başlatmak için hücreleri peksofajiyi aktive etmeye zorlar (hasarlı peroksizomun otofaji ile uzaklaştırılması). Burada, ROS kaynaklı peroksizomal hasarın talep üzerine tetiklenmesi için bir yaklaşım özetliyoruz. Protokol, 16,17,18,19,20 organelleri içinde ışıkla aktive edilen ROS üretiminden yararlanır (Şekil 1). Boya etiketli peroksizomlar aydınlatılır ve peroksizomal lümen içinde ROS üretimine yol açar, bu da özellikle peroksizomal hasarı tetikler. Bu protokolü kullanarak, ROS stresli peroksizomların ubikitine bağımlı bir bozunma yolu ile uzaklaştırıldığı gösterilmiştir. ROS stresli peroksizomlar, ubikitin E3 ligaz Stub1’i, peksofaji16 ile bireysel olarak uzaklaştırılmak üzere otofagozomlara yutulmalarına izin vermek için işe alırlar. Bu protokol, aynı hücre içindeki yaralı ve sağlıklı peroksizomların kaderini hızlandırılmış mikroskopi ile karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda bir kültür kabındaki tüm peroksizomlara (tüm hücrelerde) küresel olarak zarar vermek için de kullanılabilir ve bu da peksofaji yolunun biyokimyasal analizine izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, peroksizomal ROS seviyelerini ışıkla yükselterek hücre kültürlerinde Stub1 aracılı peksofajinin nasıl tetikleneceğini ayrıntılarıyla açıklar. Protokol boya destekli ROS üretimine dayandığından, ilgili hücreler içinde diKillerRed-VKSKL veya boya etiketli SLP ligand boyamasının yeterli ekspresyonunun sağlanması gerekir. Farklı hücre tiplerinin veya farklı genetik geçmişlere sahip hücrelerin biraz farklı özelliklere sahip peroksizomları barındırabileceği göz önüne alınd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Tayvan’daki Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi’nden MOST 111-2311-B-001-019-MY3 araştırma hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
Riferimenti
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
- He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
- Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
- Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).
- Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
- Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
- Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
- Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
- Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -. C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
- Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
- Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
- Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
- Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
- Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
- Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
- Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
- Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
- Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).
