Bepaling van zelf-(in)compatibiliteit en inter-(in)compatibiliteitsrelaties in citrusvruchten met behulp van handmatige bestuiving, microscopie en S-genotype-analyses
Summary
Dit protocol biedt een snelle methode voor het bepalen van stuifmeelcompatibiliteit en incompatibiliteit in citruscultivars.
Abstract
Citrus maakt gebruik van op S-RNase gebaseerde zelfincompatibiliteit om zelfpollen af te wijzen en vereist daarom nabijgelegen bestuiverbomen voor succesvolle bestuiving en bevruchting. Het identificeren van geschikte variëteiten om als bestuivers te dienen, is echter een tijdrovend proces. Om dit probleem op te lossen, hebben we een snelle methode ontwikkeld voor het identificeren van bestuivingscompatibele citruscultivars die gebruik maakt van agarose-gel-elektroforese en anilineblauwe kleuring. Pollencompatibiliteit wordt bepaald op basis van de identificatie van S-genotypen door het totale DNA te extraheren en PCR-gebaseerde genotyperingstests uit te voeren met specifieke primers. Bovendien worden stijlen 3-4 dagen na handmatige bestuiving verzameld en wordt anilineblauwe kleuring uitgevoerd. Ten slotte wordt de groeistatus van de pollenbuizen waargenomen met een fluorescentiemicroscoop. Pollencompatibiliteit en -incompatibiliteit kunnen worden vastgesteld door te observeren of de groei van de stuifmeelbuis respectievelijk normaal of onderdrukt is. Vanwege zijn eenvoud en kosteneffectiviteit is deze methode een effectief hulpmiddel voor het bepalen van de stuifmeelcompatibiliteit en incompatibiliteit van verschillende citrusvariëteiten om incompatibiliteitsgroepen en incompatibiliteitsrelaties tussen verschillende cultivars vast te stellen. Deze methode levert informatie die essentieel is voor de succesvolle selectie van geschikte bestuiverbomen en vergemakkelijkt zo de oprichting van nieuwe boomgaarden en de selectie van geschikte ouders voor fokprogramma’s.
Introduction
Zelfincompatibiliteit (SI) is een genetisch gecontroleerd mechanisme dat aanwezig is in ongeveer 40% van de angiospermsoorten. In dit proces stoot de stamper stuifmeel af van een plant met hetzelfde SI-genotype en voorkomt zo zelfbevruchting 1,2. Ma jia pummelo is een lokale variëteit in de provincie Jinagsu, China, met de uitstekende kwaliteiten van groot, roze fruit, een rijk sapgehalte, een zoetzure smaak en een dikke schil3. Hoewel SI outcrossing bevordert, heeft het een negatieve invloed op de opbrengst en kwaliteit van fruit4 en vereist het geschikte bestuiverbomen met verschillende SI-genotypen voor betrouwbare vruchtzettingssnelheden en hoge opbrengsten. Op dit moment zijn er twee hoofdtypen SI, sporofytische zelfincompatibiliteit (SSI), vertegenwoordigd door Brassicaceae, en gametofytische zelfincompatibiliteit (GSI), vertegenwoordigd door Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae en Solanaceae 5,6,7,8.
Citrus is een van de belangrijkste fruitgewassen ter wereld. Het op S-RNase gebaseerde GSI-systeem is te vinden in veel citrustoetredingen en heeft een negatieve invloed op de vruchtzettingssnelheid9. In dit systeem wordt SI gecontroleerd door de S-locus, een enkele polymorfe locus met twee complexe allelen die stamper S-determinanten en stuifmeel S-determinanten 7 dragen. De vrouwelijke determinant is de S ribonuclease (S-RNase), en de mannelijke determinant is de S locus F-box (SLF)7. De cellen van de stamper scheiden S-RNase-eiwitten af. De niet-zelf S-RNases worden herkend door de SLF-eiwitten, wat leidt tot de ubiquitinatie en afbraak van de niet-zelf S-RNases door de 26S proteasoomroute. Daarentegen zijn de zelf S-RNases in staat om de groei van stuifmeelbuis (PT) te accumuleren en te remmen omdat ze de SLF-eiwitten ontwijken en daarom worden voorkomen van ubiquitinzatie10,11,12,13.
Hier rapporteren we een in vivo techniek die nuttig is voor het identificeren van S-genotypen en graden van pollencompatibiliteit en incompatibiliteit. Het protocol omvat het extraheren van totaal DNA uit bladeren en het voorspellen van het S-genotype met behulp van S-specifieke primers. Bovendien leveren anilineblauwe kleuring en fluorescentiemicroscopie gevolgd door handbestuiving bewijs voor de mate van compatibiliteit en incompatibiliteit. De semi-in vivo bestuivingsprocedure, waarbij bloemen handmatig worden bestuifd in het laboratorium14,15, is ook aangepast om de mate van zelfcompatibiliteit en incompatibiliteit te beoordelen. We hebben echter ook veldbestuiving gebruikt, gevolgd door het zakken van bloemen om besmetting door ongewenst stuifmeel te voorkomen, zodat de stuifmeelbuizen zich in natuurlijke omstandigheden kunnen ontwikkelen. Dit protocol is eenvoudig en duidelijk en biedt de informatie die nodig is voor de succesvolle selectie van geschikte bestuiverbomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In fruitgewassen zijn zowel parthenocarpie als SI belangrijke eigenschappen omdat ze de weg vrijmaken voor pitloos fruit – een eigenschap die zeer wordt gewaardeerd door consumenten. Zelfincompatibiliteit bevordert de afwijzing van zelfpollen en voorkomt zo inteelt20. Onder citrusvruchten is pummelo een zelfincompatibele variëteit7. Bijna 40% van alle angiospermsoorten vertonen SI21. Deze eigenschap voorkomt het zetten van fruit, verlaagt de opbreng…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523).
Materials
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
Riferimenti
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al. Species selection maintains self-incompatibility. Science. 330 (6003), 493-495 (2010).
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T. S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata. Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. . Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D. Incompatibility in angiosperms. Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
