Determinação das relações de auto-(in)compatibilidade e (in)compatibilidade em citros utilizando polinização manual, microscopia e análises de genótipo S
Summary
Este protocolo fornece um método rápido para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica em cultivares de citros.
Abstract
Os citros usam a autoincompatibilidade baseada em S-RNase para rejeitar o autopólen e, portanto, requer árvores polinizadoras próximas para o sucesso da polinização e fertilização. No entanto, identificar variedades adequadas para servir como polinizadores é um processo demorado. Para resolver este problema, desenvolvemos um método rápido para identificar cultivares de citros compatíveis com polinização que utiliza eletroforese em gel de agarose e coloração com azul de anilina. A compatibilidade polínica é determinada com base na identificação de genótipos S por meio da extração de DNA total e da realização de ensaios de genotipagem baseados em PCR com primers específicos. Além disso, os estilos são coletados 3-4 dias após a polinização manual, e a coloração com azul de anilina é realizada. Finalmente, o estado de crescimento dos tubos polínicos é observado com um microscópio de fluorescência. A compatibilidade e a incompatibilidade polínica podem ser estabelecidas observando-se se o crescimento do tubo polínico é normal ou suprimido, respectivamente. Devido à sua simplicidade e custo-efetividade, este método é uma ferramenta eficaz para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica de diferentes variedades de citros para estabelecer grupos de incompatibilidade e relações de incompatibilidade entre diferentes cultivares. Este método fornece informações essenciais para o sucesso da seleção de polinizadores adequados e, assim, facilita o estabelecimento de novos pomares e a seleção de genitores apropriados para programas de melhoramento.
Introduction
A autoincompatibilidade (IE) é um mecanismo geneticamente controlado presente em aproximadamente 40% das espécies de angiospermas. Nesse processo, o pistilo rejeita o pólen de uma planta com o mesmo genótipo SI e, assim, impede a autofecundação 1,2. Ma jia pummelo é uma variedade local na província de Jinagsu, China, com as excelentes qualidades de frutas grandes e cor-de-rosa, um rico teor de suco, um sabor doce e azedo e uma casca grossa3. Embora o SI promova o cruzamento, ele impacta negativamente a produtividade e a qualidade dos frutos4 e necessita de árvores polinizadoras adequadas com genótipos distintos de SI para taxas de frutificação confiáveis e altas produtividades. Atualmente, existem dois tipos principais de SI, a autoincompatibilidade esporofítica (ISC), representada por Brassicaceae, e a autoincompatibilidade gametofítica (IGS), representada por Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae e Solanaceae 5,6,7,8.
A citricultura é uma das culturas frutíferas mais importantes do mundo. O sistema GSI à base de S-RNase é encontrado em muitos acessos de citros e influencia negativamente a taxa de frutificação9. Nesse sistema, o SI é controlado pelo locus S, um único locus polimórfico com dois alelos complexos que carregam determinantes do pistilo S e determinantes do pólen S 7. O determinante feminino é a ribonuclease S (S-RNase), e o masculino é o locus S F-box (SLF)7. As células do pistilo secretam proteínas S-RNase. As RNAs-S não-auto são reconhecidas pelas proteínas SLF, o que leva à ubiquitinação e degradação das S-RNases não-auto pela via do proteassoma 26S. Em contrapartida, as auto-S-RNases são capazes de acumular e inibir o crescimento do tubo polínico (TP), pois escapam das proteínas SLF e, portanto, são impedidas de ubiquitinzação10,11,12,13.
Aqui, relatamos uma técnica in vivo que é útil para identificar genótipos S e graus de compatibilidade e incompatibilidade polínica. O protocolo envolve a extração de DNA total das folhas e a predição do genótipo S por meio de primers S-específicos. Além disso, a coloração com azul de anilina e a microscopia de fluorescência seguida de polinização manual fornecem evidências do grau de compatibilidade e incompatibilidade. O procedimento de polinização semi in vivo, que envolve a polinização manual das flores em laboratório14,15, também foi adaptado para avaliar os graus de autocompatibilidade e incompatibilidade. No entanto, também utilizamos a polinização a campo seguida do ensacamento das flores para evitar a contaminação por pólen indesejado para permitir que os tubos polínicos se desenvolvam em condições naturais. Este protocolo é simples e direto e fornece as informações necessárias para a seleção bem-sucedida de árvores polinizadoras adequadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em fruticulturas, tanto a partenocarpia quanto o SI são características importantes, pois abrem caminho para frutos sem sementes – uma característica muito apreciada pelos consumidores. A autoincompatibilidade promove a rejeição do autopólen e, assim, previne a endogamia20. Entre os citros, o pummelo é uma variedade auto-incompatível7. Quase 40% de todas as espécies de angiospermas apresentam SI21. Essa característica impede a frutificaçã…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32122075, 32072523).
Materials
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
Riferimenti
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