Summary

Kanser Hücre Hatlarından Elde Edilen Düşük Endotoksin İçeriği Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

Önerilen protokol, hücre dışı veziküllerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu sırasında endotoksin ile kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir.

Abstract

Hücre dışı veziküller (EV’ler), in vitro ve in vivo hücreler tarafından salınan heterojen bir membran vezikülü popülasyonudur. Her yerde bulunmaları ve biyolojik bilgi taşıyıcıları olarak önemli rolleri, onları izolasyonları için güvenilir ve tekrarlayan protokoller gerektiren ilgi çekici çalışma nesneleri haline getirir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü araştırmalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır (uygun edinim gibi). Bu çalışma, küçük EV’lerin (MISEV 2018 terminolojisine göre) diferansiyel santrifüjlemeye dayalı tümör hücre hatlarının kültür süpernatantından izolasyonu için bir protokol sunmaktadır. Protokol, EV’lerin izolasyonu sırasında endotoksinlerle kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir. EV’lerin endotoksin kontaminasyonu, sonraki deneyleri önemli ölçüde engelleyebilir veya hatta gerçek biyolojik etkilerini maskeleyebilir. Öte yandan, gözden kaçan endotoksinlerin varlığı yanlış sonuçlara yol açabilir. Bu, monositler de dahil olmak üzere bağışıklık sisteminin hücrelerine atıfta bulunurken özellikle önemlidir, çünkü monositler endotoksin kalıntılarına özellikle duyarlı bir popülasyon oluşturur. Bu nedenle, özellikle monositler, makrofajlar, miyeloid türevli baskılayıcı hücreler veya dendritik hücreler gibi endotoksine duyarlı hücrelerle çalışırken, EV’lerin endotoksin kontaminasyonu açısından taranması şiddetle tavsiye edilir.

Introduction

MISEV 2018 terminolojisine göre hücre dışı veziküller (EV’ler), çok sayıda fizyolojik ve patolojik süreçte çok önemli rol oynayan hücre salgılanan membranöz veziküllerin çeşitli alt tiplerini tanımlayan kolektif bir terimdir 1,2. Dahası, EV’ler çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler, terapötik ajanlar ve ilaç dağıtım araçları olarak umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü satın almalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır3. Böyle bir zorluk, birçok durumda ihmal edilen endotoksin içermeyen EV’lerin izolasyonudur. En yaygın endotoksinlerden biri, gram-negatif bakteriyel hücre duvarlarının önemli bir bileşeni olan veçeşitli hücreler tarafından çok sayıda enflamatuar sitokinin salınması nedeniyle akut enflamatuar yanıta neden olabilen lipopolisakkarittir (LPS) 4,5. LPS, LPS bağlayıcı proteine bağlanarak bir yanıt indükler, ardından miyeloid hücreler üzerinde CD14 / TLR4 / MD2 kompleksi ile etkileşime girer. Bu etkileşim, MyD88 ve TRIF’e bağımlı sinyal yollarının aktivasyonuna yol açar ve bu da nükleer faktör kappa B’yi (NFkB) tetikler. NFkB’nin çekirdeğe translokasyonu, sitokinlerin üretimini başlatır6. Monositler ve makrofajlar LPS’ye karşı oldukça hassastır ve LPS’ye maruz kalmaları enflamatuar sitokinlerin ve kemokinlerin (örneğin, IL-6, IL-12, CXCL8 ve TNF-α) salınımına neden olur7,8. CD14 yapısı, benzer afiniteye sahip farklı LPS türlerinin bağlanmasını sağlar ve diğer toll-like reseptörleri (TLR’ler) için bir ko-reseptör görevi görür (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 ve 9)6. EV’lerin monositler / makrofajlar üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmaların sayısı halaartmaktadır 9,10,11. Özellikle monositlerin, alt popülasyonlarının ve diğer bağışıklık hücrelerinin fonksiyonlarını incelemek açısından bakıldığında, EV’lerde endotoksin varlığı ve hatta maskelenmiş varlığı büyük önem taşımaktadır12. EV’lerin endotoksinlerle göz ardı edilen kontaminasyonu, yanıltıcı sonuçlara yol açabilir ve gerçek biyolojik aktivitelerini gizleyebilir. Başka bir deyişle, monositik hücrelerle çalışmak, endotoksin kontaminasyonunun yokluğunda güven gerektirir13. Endotoksinlerin potansiyel kaynakları su, ticari olarak elde edilen ortam ve serumlar, ortam bileşenleri ve katkı maddeleri, laboratuvar cam eşyaları ve plastik eşyalar olabilir 5,14,15.

Bu nedenle, bu çalışma düşük endotoksin içeren EV’lerin izolasyonu için bir protokol geliştirmeyi amaçlamıştır. Protokol, endotoksinleri EV’lerden çıkarmak yerine, EV’lerin izolasyonu sırasında endotoksin kontaminasyonunun nasıl önleneceğine dair basit ipuçları sağlar. Daha önce, endotoksinlerin, örneğin nanotıpta kullanılan mühendislik nanopartiküllerinden nasıl çıkarılacağına dair birçok protokol sunulmuştu; ancak, hiçbiri EV’ler gibi biyolojik yapılar için yararlı değildir. Nanopartiküllerin etkili depirojenasyonu, etanol veya asetik asit durulama, 3 saat boyunca 175 ° C’de ısıtma, γ ışınlama veya triton X-100 muamelesi ile gerçekleştirilebilir; ancak, bu prosedürler EV’lerin 16,17’nin tahrip olmasına yol açmaktadır.

Sunulan protokol, EV’lerin monositler üzerindeki etkisi üzerine yapılan önceki çalışmaların aksine, EV’lerde endotoksin safsızlıklarından kaçınmaya odaklanan öncü bir çalışmadır9. Önerilen ilkelerin laboratuvar uygulamalarına uygulanması, EV’lerin klinikte terapötik ajanlar olarak potansiyel kullanımı göz önüne alındığında çok önemli olabilecek güvenilir araştırma sonuçlarının elde edilmesine yardımcı olabilir12.

Protocol

1. Ultra santrifüj tüplerinin hazırlanması Steril, tek kullanımlık tüpler kullanın. Bu mümkün değilse, ultrasantrifüj tüplerini steril bir Pasteur pipet veya diğer tek kullanımlık aplikatörler kullanarak bir deterjanla yıkadıktan sonra tekrar kullanın. Ultra santrifüj tüplerinin bir tür santrifüjlü malzemeye (hücre kültürü süpernatan / serum / plazma) ve türlere (insan / fare / vb.) Bir deterjanla yıkadıktan sonra, ultra santrifüj tüplerini deiyonize…

Representative Results

Bu protokol için ön koşul veya zorunlu bir adım, olası endotoksin kontaminasyonunun reaktiflerden dışlanmasıdır. FBS, DMEM, RPMI, PBS ve hatta ultrasantrifüj tüpleri gibi kullanılan tüm reaktifler endotoksin içermemelidir (<0.005 AB / mL). Endotoksin kontaminasyonu olmayan rejimin sürdürülmesi kolay değildir, çünkü örneğin, hücre kültürü için düzenli / standart serum zengin kaynağı olabilir (0.364 AB / mL; bakınız Tablo 1). Bu protokol düşük…

Discussion

Son birkaç yılda, uygun EV’lerin izolasyonu için yöntemler giderek daha önemli hale geldi ve örneğin güvenilir omikler ve fonksiyonel veriler elde etme bağlamında daha güvenilir analizleri mümkün kıldı24. Önceki araştırma deneyimlerine dayanarak, sadece izolasyon yönteminin türünün değil, aynı zamanda bu prosedür sırasındaki diğer koşulların da önemli olabileceği görülmektedir. EV tükenmiş FBS’nin kullanımı yaygın olarak bir gereklilik olarak kabul edilmekted…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Polonya Ulusal Bilim Merkezi, 2019/33/B/NZ5/00647 hibe numarası ile desteklenmiştir. Jagiellonian Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü’nden Profesör Tomasz Gosiewski ve Agnieszka Krawczyk’e EV’lerde bakteri DNA’sının tespitinde paha biçilmez yardımları için teşekkür ederiz.

Materials

 Alix (3A9) Mouse mAb  Cell Signaling Technology 2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic GoogLab Scientific GBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow Cytometr BD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II BD Biosciences 551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 13174
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad Laboratories, Inc.  17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)  Corning 10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate Reader BIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine Serum Gibco 16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin  Biowest  S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL  PAN – Biotech P06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2005
Immun-Blot PVDF Membrane Bio-Rad Laboratories, Inc.  1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)  Enzo Life Sciences, Inc. ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Bio-Rad Laboratories, Inc.  1703930
Nanoparticle Tracking Analysis  Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)  Invitrogen  NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)  Invitrogen NP0004
Parafilm Sigma Aldrich P7793 transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA Ladder EURx E3141-01 
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit Thermo Scientific A39552
PP Oak Ridge Tube with sealing caps Thermo Scientific 3929, 03613
RPMI 1640 RPMI-1640 (Gibco) 11875093
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystem A24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor Thermo Scientific 75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System Bio-Rad Laboratories, Inc.  1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34577
SW480 cell line American Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell line American Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 um TPP 99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad Laboratories, Inc.  1703940 Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mL SARSTEDT 86.1171.001

Riferimenti

  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
  3. van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
  4. Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
  5. Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
  6. Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
  7. Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
  8. Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750 (2017).
  9. Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
  10. Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
  11. Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
  12. Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics – an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
  13. Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
  14. Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
  15. Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
  16. Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs – How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
  19. Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
  20. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  21. Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
  22. Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
  23. Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
  24. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
  25. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
  26. Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when ‘exosome-depleted serum’ is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
  27. Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
  28. Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
  29. Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
  30. Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
  31. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
  32. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).

Play Video

Citazione di questo articolo
Babula, A., Siemińska, I., Baj-Krzyworzeka, M. Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (192), e65062, doi:10.3791/65062 (2023).

View Video