Isolatie van extracellulaire blaasjes met een laag endotoxinegehalte afgeleid van kankercellijnen
Summary
Het voorgestelde protocol bevat richtlijnen over hoe besmetting met endotoxine kan worden voorkomen tijdens de isolatie van extracellulaire blaasjes uit celkweeksupernatanten en hoe deze op de juiste manier kunnen worden geëvalueerd.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV’s) zijn een heterogene populatie van membraanblaasjes die door cellen in vitro en in vivo worden vrijgegeven. Hun alomtegenwoordigheid en belangrijke rol als dragers van biologische informatie maken hen tot intrigerende studieobjecten, die betrouwbare en repetitieve protocollen vereisen voor hun isolatie. Het realiseren van hun volledige potentieel is echter moeilijk omdat er nog steeds veel technische obstakels zijn die verband houden met hun onderzoek (zoals de juiste acquisitie). Deze studie presenteert een protocol voor de isolatie van kleine EV’s (volgens de MISEV 2018-nomenclatuur) uit het kweeksupernatant van tumorcellijnen op basis van differentiële centrifugatie. Het protocol bevat richtlijnen over hoe besmetting met endotoxinen tijdens de isolatie van EV’s kan worden voorkomen en hoe deze goed kunnen worden geëvalueerd. Endotoxinebesmetting van EV’s kan latere experimenten aanzienlijk belemmeren of zelfs hun ware biologische effecten maskeren. Aan de andere kant kan de over het hoofd geziene aanwezigheid van endotoxinen leiden tot onjuiste conclusies. Dit is van bijzonder belang wanneer wordt verwezen naar cellen van het immuunsysteem, waaronder monocyten, omdat monocyten een populatie vormen die bijzonder gevoelig is voor endotoxineresiduen. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om EV’s te screenen op endotoxinebesmetting, vooral bij het werken met endotoxinegevoelige cellen zoals monocyten, macrofagen, van myeloïden afgeleide suppressorcellen of dendritische cellen.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EV’s), volgens de MISEV 2018-nomenclatuur, zijn een verzamelnaam die verschillende subtypen van door cellen uitgescheiden vliezige blaasjes beschrijft die een cruciale rol spelen in tal van fysiologische en pathologische processen 1,2. Bovendien zijn EV’s veelbelovend als nieuwe biomarkers voor verschillende ziekten, evenals therapeutische middelen en voertuigen voor medicijnafgifte. Het realiseren van hun volledige potentieel is echter moeilijk omdat er nog steeds veel technische obstakels zijn met betrekking tot hun overname3. Een van die uitdagingen is de isolatie van endotoxinevrije EV’s, die in veel gevallen is verwaarloosd. Een van de meest voorkomende endotoxinen is lipopolysaccharide (LPS), dat een belangrijk onderdeel is van gramnegatieve bacteriële celwanden en een acute ontstekingsreactie kan veroorzaken, als gevolg van de afgifte van een groot aantal inflammatoire cytokines door verschillende cellen 4,5. LPS induceert een respons door binding aan LPS-bindend eiwit, gevolgd door interactie met het CD14/TLR4/MD2-complex op myeloïde cellen. Deze interactie leidt tot de activering van MyD88- en TRIF-afhankelijke signaalroutes, die op hun beurt de nucleaire factor kappa B (NFkB) activeren. Translocatie van NFkB naar de kern initieert de productie van cytokines6. Monocyten en macrofagen zijn zeer gevoelig voor LPS en hun blootstelling aan LPS resulteert in een afgifte van inflammatoire cytokines en chemokines (bijv. IL-6, IL-12, CXCL8 en TNF-α)7,8. De CD14-structuur maakt de binding van verschillende LPS-soorten met vergelijkbare affiniteit mogelijk en dient als co-receptor voor andere toll-like receptoren (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 en 9)6. Het aantal studies dat wordt uitgevoerd naar de effecten van EV’s op monocyten/macrofagen neemt nog steeds toemet 9,10,11. Vooral vanuit het perspectief van het bestuderen van de functies van monocyten, hun subpopulaties en andere immuuncellen, is de aanwezigheid van endotoxine en zelfs hun gemaskeerde aanwezigheid in EV’s van groot belang12. De over het hoofd geziene besmetting van EV’s met endotoxinen kan leiden tot misleidende conclusies en hun ware biologische activiteit verbergen. Met andere woorden, het werken met monocytische cellen vereist vertrouwen in de afwezigheid van endotoxinebesmetting13. Potentiële bronnen van endotoxinen kunnen water, commercieel verkregen media en sera, mediacomponenten en additieven, laboratoriumglaswerk en plasticwarezijn 5,14,15.
Daarom was deze studie gericht op het ontwikkelen van een protocol voor de isolatie van laag-endotoxine-bevattende EV’s. Het protocol geeft eenvoudige tips over hoe endotoxinebesmetting tijdens EV-isolatie kan worden voorkomen in plaats van endotoxinen uit EV’s te verwijderen. Eerder zijn veel protocollen gepresenteerd over het verwijderen van endotoxinen uit bijvoorbeeld gemanipuleerde nanodeeltjes die worden gebruikt in de nanogeneeskunde; geen van hen is echter nuttig voor biologische structuren zoals EV’s. De effectieve depyrogenering van nanodeeltjes kan worden uitgevoerd door ethanol- of azijnzuurspoeling, verwarming bij 175 °C gedurende 3 uur, γ bestraling of triton X-100-behandeling; deze procedures leiden echter tot de vernietiging van EV’s16,17.
Het gepresenteerde protocol is een baanbrekend onderzoek gericht op het vermijden van endotoxine onzuiverheden in EV’s, in tegenstelling tot eerdere studies over het effect van EV’s op monocyten9. Het toepassen van voorgestelde principes op de laboratoriumpraktijk kan helpen om betrouwbare onderzoeksresultaten te verkrijgen, wat cruciaal kan zijn bij het overwegen van het potentiële gebruik van EV’s als therapeutische middelen in de kliniek12.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de afgelopen jaren zijn methoden voor een goede EV-isolatie steeds belangrijker geworden, waardoor hun verdere betrouwbare analyses mogelijk zijn, bijvoorbeeld in het kader van het verkrijgen van betrouwbare omica en functionele gegevens24. Op basis van eerdere onderzoekservaring lijkt het erop dat niet alleen het type isolatiemethode, maar ook andere aandoeningen tijdens deze procedure belangrijk kunnen zijn. Het gebruik van EV-uitgeputte FBS wordt algemeen erkend als een noodzaak<sup class="x…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Science Centre, Polen, subsidienummer 2019/33/B/NZ5/00647. We willen professor Tomasz Gosiewski en Agnieszka Krawczyk van de afdeling Moleculaire Medische Microbiologie, Jagiellonian University Medical College bedanken voor hun onschatbare hulp bij de detectie van bacterieel DNA in EV’s.
Materials
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
Riferimenti
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750 (2017).
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics – an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs – How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when ‘exosome-depleted serum’ is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
