Isolamento di vescicole extracellulari a basso contenuto di endotossine derivate da linee cellulari tumorali
Summary
Il protocollo proposto include linee guida su come evitare la contaminazione con endotossina durante l’isolamento di vescicole extracellulari da supernatanti di coltura cellulare e su come valutarle correttamente.
Abstract
Le vescicole extracellulari (EV) sono una popolazione eterogenea di vescicole di membrana rilasciate dalle cellule in vitro e in vivo. La loro onnipresenza e il ruolo significativo come portatori di informazioni biologiche li rendono oggetti di studio intriganti, che richiedono protocolli affidabili e ripetitivi per il loro isolamento. Tuttavia, realizzare il loro pieno potenziale è difficile in quanto ci sono ancora molti ostacoli tecnici legati alla loro ricerca (come l’acquisizione corretta). Questo studio presenta un protocollo per l’isolamento di piccole EV (secondo la nomenclatura MISEV 2018) dalla coltura surnatante di linee cellulari tumorali basate sulla centrifugazione differenziale. Il protocollo include linee guida su come evitare la contaminazione con endotossine durante l’isolamento delle EV e su come valutarle correttamente. La contaminazione da endotossine delle EV può ostacolare significativamente gli esperimenti successivi o addirittura mascherare i loro veri effetti biologici. D’altra parte, la presenza trascurata di endotossine può portare a conclusioni errate. Ciò è di particolare importanza quando ci si riferisce alle cellule del sistema immunitario, compresi i monociti, perché i monociti costituiscono una popolazione particolarmente sensibile ai residui di endotossine. Pertanto, è altamente raccomandato eseguire lo screening delle EV per la contaminazione da endotossine, specialmente quando si lavora con cellule sensibili all’endotossina come monociti, macrofagi, cellule soppressori derivate da mieloidi o cellule dendritiche.
Introduction
Le vescicole extracellulari (EV), secondo la nomenclatura MISEV 2018, sono un termine collettivo che descrive vari sottotipi di vescicole membranose secrete da cellule che svolgono ruoli cruciali in numerosi processi fisiologici e patologici 1,2. Inoltre, i veicoli elettrici sono promettenti come nuovi biomarcatori per varie malattie, nonché agenti terapeutici e veicoli di somministrazione di farmaci. Tuttavia, realizzare il loro pieno potenziale è difficile in quanto ci sono ancora molti ostacoli tecnici legati alla loro acquisizione3. Una di queste sfide è l’isolamento delle EV prive di endotossine, che è stato trascurato in molti casi. Una delle endotossine più comuni è il lipopolisaccaride (LPS), che è un componente importante delle pareti cellulari batteriche gram-negative e può causare una risposta infiammatoria acuta, a causa del rilascio di un gran numero di citochine infiammatorie da parte di varie cellule 4,5. LPS induce una risposta legandosi alla proteina legante LPS, seguita dall’interazione con il complesso CD14/TLR4/MD2 sulle cellule mieloidi. Questa interazione porta all’attivazione di vie di segnalazione dipendenti da MyD88 e TRIF, che a loro volta innescano il fattore nucleare kappa B (NFkB). La traslocazione di NFkB nel nucleo avvia la produzione di citochine6. I monociti e i macrofagi sono altamente sensibili agli LPS e la loro esposizione agli LPS provoca un rilascio di citochine infiammatorie e chemochine (ad esempio, IL-6, IL-12, CXCL8 e TNF-α)7,8. La struttura CD14 consente il legame di diverse specie di LPS con affinità simile e funge da co-recettore per altri recettori toll-like (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 e 9)6. Il numero di studi condotti sugli effetti delle EV sui monociti/macrofagi è ancora in aumentodi 9,10,11. Soprattutto dal punto di vista dello studio delle funzioni dei monociti, delle loro sottopopolazioni e di altre cellule immunitarie, la presenza di endotossine e persino la loro presenza mascherata nelle EV è di grande importanza12. La contaminazione trascurata delle EV con endotossine può portare a conclusioni fuorvianti e nascondere la loro vera attività biologica. In altre parole, lavorare con cellule monocitiche richiede fiducia in assenza di contaminazione da endotossine13. Le potenziali fonti di endotossine possono essere acqua, terreni e sieri ottenuti commercialmente, componenti e additivi dei supporti, vetreria da laboratorio e articoli in plastica 5,14,15.
Pertanto, questo studio mirava a sviluppare un protocollo per l’isolamento di EV contenenti endotossine basse. Il protocollo fornisce semplici suggerimenti su come evitare la contaminazione da endotossine durante l’isolamento delle EV invece di rimuovere le endotossine dalle EV. In precedenza, sono stati presentati molti protocolli su come rimuovere le endotossine, ad esempio, dalle nanoparticelle ingegnerizzate utilizzate in nanomedicina; tuttavia, nessuno di essi è utile per strutture biologiche come i veicoli elettrici. L’efficace depirogenazione delle nanoparticelle può essere effettuata mediante risciacquo con etanolo o acido acetico, riscaldamento a 175 °C per 3 ore, irradiazione γ o trattamento tritone X-100; tuttavia, queste procedure portano alla distruzione dei veicoli elettrici16,17.
Il protocollo presentato è uno studio pionieristico incentrato sull’evitare le impurità delle endotossine nelle EV, a differenza dei precedenti studi sull’effetto delle EV sui monociti9. L’applicazione dei principi proposti alla pratica di laboratorio può aiutare a ottenere risultati di ricerca affidabili, che possono essere cruciali quando si considera il potenziale uso di EV come agenti terapeutici nella clinica12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi anni, i metodi per un corretto isolamento dei veicoli elettrici sono diventati sempre più importanti, consentendo loro ulteriori analisi affidabili, ad esempio, nel contesto dell’ottenimento di omiche affidabili e dati funzionali24. Sulla base di precedenti esperienze di ricerca, sembra che non solo il tipo di metodo di isolamento, ma anche altre condizioni durante questa procedura possano essere importanti. L’uso di FBS impoveriti di EV è ampiamente riconosciuto come una necessità…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Centre, Polonia, numero di sovvenzione 2019/33/B/NZ5/00647. Vorremmo ringraziare il professor Tomasz Gosiewski e Agnieszka Krawczyk del Dipartimento di Microbiologia Medica Molecolare, Jagiellonian University Medical College per il loro inestimabile aiuto nella rilevazione del DNA batterico nelle EV.
Materials
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
Riferimenti
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