رسم الخرائط البصرية مزدوجة الصبغة للقلوب من الفئران RyR2R2474S من عدم انتظام دقات القلب البطيني متعدد الأشكال الكاتيكولاميني
Summary
يقدم هذا البروتوكول خرائط بصرية مزدوجة الصبغة لقلوب الفئران التي تم الحصول عليها من البرية المتأثرة بعدم انتظام دقات القلب البطيني متعدد الأشكال الكاتيكولاميني ، بما في ذلك القياسات الفيزيولوجية الكهربية للجهد عبر الغشاء والعابرين داخل الخلايا Ca2+ بدقة زمنية ومكانية عالية.
Abstract
يظهر اضطراب القلب المؤيد لعدم انتظام ضربات القلب الكاتيكولامينية متعدد الأشكال (CPVT) على شكل نوبات تسرع القلب البطيني متعدد الأشكال بعد النشاط البدني أو الإجهاد أو تحدي الكاتيكولامين ، والتي يمكن أن تتدهور إلى رجفان بطيني قاتل. قلب الفأر هو نوع واسع الانتشار لنمذجة أمراض عدم انتظام ضربات القلب الموروثة ، بما في ذلك CPVT. إن رسم الخرائط البصرية المتزامنة لإمكانات الغشاء (Vm) وعابرات الكالسيوم (CaT) من قلوب الفئران ذات الأداء Langendorff لديه القدرة على توضيح الآليات الكامنة وراء عدم انتظام ضربات القلب. بالمقارنة مع التحقيق على المستوى الخلوي ، يمكن لتقنية رسم الخرائط الضوئية اختبار بعض المعلمات الكهربية ، مثل تحديد التنشيط وسرعة التوصيل ومدة جهد الفعل ومدة CaT. يقدم هذا البحث إعداد الأجهزة والإجراء التجريبي لرسم الخرائط البصرية عالية الإنتاجية ل CaT و Vm في قلوب RyR2-R2474S / + من النوع البري وغير المتجانس ، جنبا إلى جنب مع السرعة الكهربائية المبرمجة قبل وأثناء تحدي الأيزوبروتيرينول. وقد أظهر هذا النهج طريقة مجدية وموثوقة لدراسة مرض CPVT ميكانيكيا في إعداد قلب الفأر خارج الجسم الحي.
Introduction
اضطراب القلب الوراثي الكاتيكولامينية يظهر تسرع القلب البطيني متعدد الأشكال (CPVT) على شكل نوبات تسرع القلب البطيني متعدد الأشكال (PVT) بعد النشاط البدني أو الإجهاد أو تحدي الكاتيكولامين ، والتي يمكن أن تتدهور إلى رجفان بطيني قاتل1،2،3،4. الأدلة الحديثة بعد تقريرها الأول كمتلازمة سريرية في عام 1995 تورطت طفرات في سبعة جينات ، وكلها متورطة في الساركوبلازم الشبكي (SR) تخزين Ca 2+ الإطلاق في هذه الحالة: مستقبلات RYR2 الأكثر شيوعا التي يتم الإبلاغ عنها لترميز RYR2 2 (RyR2) من قنوات إطلاق Ca2+ 5,6 ، FKBP12.67 ، CASQ2 ترميز كالسيكوسترين القلب8 ، TRDN ترميز بروتين SR التقاطعtriadin 9 و CALM1 9 و CALM2 10 و CALM3 بترميز الكالمودولين11,12 بشكل متطابق. تعزو هذه الأنماط الجينية أحداث عدم انتظام ضربات القلب إلى الإطلاق المرضي غير المنظم لمخزن SR Ca2 + 12.
يمكن اكتشاف إطلاق Ca 2+ التلقائي من SR على شكل شرارات Ca 2+ أو موجات Ca 2+ ، والتي تنشط مبادل Na + / Ca 2+ (NCX). يولد مبادل واحد Ca2+ لثلاثة Na + تيارا داخليا ، مما يسرع من إزالة الاستقطاب الانبساطي ويدفع جهد الغشاء إلى عتبة جهد الفعل (AP). في الفئران RyR2 ، يؤدي النشاط المتزايد ل RyR2R4496C في العقدة الجيبية الأذينية (SAN) إلى انخفاض غير متوقع في تلقائية SAN بواسطة انخفاض يعتمد على الكالسيوم2 + لاستنفاد ICa و L و SR Ca 2+ أثناء الانبساط ، وتحديد التغيرات الفيزيولوجية المرضية تحت الخلوية التي تساهم في خلل SAN في مرضى CPVT13,14. من المرجح حدوث موجات Ca 2+ الخلوية ذات الصلة بالخلايا العضلية القلبية بعد الزيادات في الخلوي الخلوي في الخلفية [Ca2+] بعد تحسس RyR بواسطة الكاتيكولامين ، بما في ذلك الأيزوبروتيرينول (ISO) ، التحدي.
لا يزال يتعين تحديد التغييرات الحركية التفصيلية في إشارات Ca 2+ بوساطة RyR2 بعد إطلاق Ca2+ بوساطة RyR2 استجابة لتنشيط جهد الفعل (AP) الذي قد يكون سبب عدم انتظام ضربات القلب البطيني المرصود في نماذج CPVT القلبية السليمة لمجموعة كاملة من الأنماط الجينية RyR2 المبلغ عنها12. تقدم هذه الورقة إعداد الأجهزة والإجراءات التجريبية لرسم خرائط عالية الإنتاجية لإشارات Ca2+ وإمكانات الغشاء (Vm) في قلوب الفئران البرية (WT) وقلوب RyR2-R2474S / + غير المتجانسة ، جنبا إلى جنب مع السرعة الكهربائية المبرمجة قبل وبعد تحدي الأيزوبروتيرينول. يوفر هذا البروتوكول طريقة للدراسة الآلية لمرض CPVT في قلوب الفئران المعزولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بناء على تجربتنا ، تتضمن مفاتيح رسم الخرائط البصرية ثنائية الصبغة الناجحة لقلب الفأر حلا وقلبا مجهزين جيدا ، وتحميل الصبغة ، وتحقيق أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء ، وتقليل قطعة أثرية للحركة.
تحضير الحل
حل كريبس ضروري لتجربة القلب الناجحة. يتم تحضير محاليل مخزون …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81700308 إلى XO و 31871181 إلى ML ، و 82270334 إلى XT) ، وبرنامج دعم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (CN) (2021YJ0206 إلى XO ، 23ZYZYTS0433 ، و 2022YFS0607 إلى XT ، و 2022NSFSC1602 إلى TC) ومختبر الدولة الرئيسي للكيمياء والهندسة الجزيئية للموارد الطبية (جامعة Guangxi Normal) (CMEMR2017-B08 إلى XO) ، MRC (G10031871181 إلى ML02647 ، G1002082 ، ML) ، BHF (PG / 14/80/31106 ، PG / 16/67/32340 ، PG / 12/21/29473 ، PG / 11/59/29004 ML) ، BHF CRE في منح أكسفورد (ML).
Materials
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
Riferimenti
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
- Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
- Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
- Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
- Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
- Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. CACNA1C-related disorders. GeneReviews. , (1993).
- Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
- Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
- Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
- Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
- Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
- O’Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- O’Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
- Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
- Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
- Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- O’Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
- Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
- Mal Baudot, ., et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
- Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
- Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
- He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
- Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).
