Optimalisatie van de Epimedii Folium Mutton-Oil Processing Technology en het testen van het effect ervan op de embryonale ontwikkeling van zebravissen
Summary
In dit protocol werd de schapenolieverwerkingstechnologie van Epimedii folium (EF) geoptimaliseerd door een Box-Behnken experimentele ontwerp-respons oppervlaktemethodologie toe te passen, en het effect van ruwe en geoptimaliseerde watergeëxtraheerde EF op de embryonale ontwikkeling van zebravissen werd voorlopig onderzocht.
Abstract
Als een traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft Epimedii folium (EF) een geschiedenis in geneeskunde en voedsel die > 2.000 jaar oud is. Klinisch wordt EF verwerkt met schapenolie vaak gebruikt als geneesmiddel. In de afgelopen jaren zijn de meldingen van veiligheidsrisico’s en bijwerkingen van producten die EF als grondstof gebruiken geleidelijk toegenomen. Verwerking kan de veiligheid van TCM effectief verbeteren. Volgens de TCM-theorie kan de verwerking van schapenolie de toxiciteit van EF verminderen en het tonificerende effect op de nieren versterken. Er is echter een gebrek aan systematisch onderzoek en evaluatie van EF-technologie voor de verwerking van schapenolie. In deze studie gebruikten we de Box-Behnken experimentele ontwerp-respons oppervlaktemethodologie om de belangrijkste parameters van de verwerkingstechnologie te optimaliseren door de inhoud van meerdere componenten te beoordelen. De resultaten toonden aan dat de optimale verwerking van schapenolie van EF als volgt was: de schapenolie verwarmen bij 120 °C ± 10 °C, de ruwe EF toevoegen, voorzichtig roerbakken tot 189 °C ± 10 °C totdat deze gelijkmatig glanzend is, en vervolgens verwijderen en afkoelen. Voor elke 100 kg EF moet 15 kg schapenolie worden gebruikt. De toxiciteiten en teratogeniciteiten van een waterig extract van ruwe en schapenolie verwerkte EF werden vergeleken in een zebravisembryo-ontwikkelingsmodel. De resultaten toonden aan dat de ruwe kruidengroep meer kans had om zebravismisvormingen te veroorzaken en dat de half-maximale dodelijke EF-concentratie lager was. Kortom, de geoptimaliseerde schapenolieverwerkingstechnologie was stabiel en betrouwbaar, met een goede herhaalbaarheid. Bij een bepaalde dosis was het waterige extract van EF giftig voor de ontwikkeling van zebravisembryo’s en de toxiciteit was sterker voor het ruwe medicijn dan voor het verwerkte medicijn. De resultaten toonden aan dat de verwerking van schapenolie de toxiciteit van ruwe EF verminderde. Deze bevindingen kunnen worden gebruikt om de kwaliteit, uniformiteit en klinische veiligheid van met schapenolie verwerkte EF te verbeteren.
Introduction
Epimedii folium (EF) is het gedroogde blad van Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., of Epimedium koreanum Nakai. EF kan worden gebruikt voor de behandeling van osteoporose, menopauzale syndroom, borstknobbels, hypertensie, coronaire hartziekten en andere ziekten1. Als traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft EF een geschiedenis in geneeskunde en voedsel van meer dan 2.000 jaar. Vanwege de lage prijs en het opmerkelijke effect van tonificatie van de nieren, wordt het veel gebruikt in medicijnen en gezonde voedingsmiddelen. EF wordt verwerkt door het te roerbakken met schapenolie, een proces dat voor het eerst werd beschreven in Lei Gong Processing Theory geschreven door Lei Xiao in de Liu Song-periode2. De werkzaamheid van ruwe EF en roergebakken EF is heel verschillend. Ruwe EF verdrijft voornamelijk reuma, terwijl de gewokte EF de nieren verwarmt om yang3 te versterken. Op dit moment wordt EF veel gebruikt als grondstof in geneesmiddelen en gezonde voedingsmiddelen; er zijn 399 beursgenoteerde Chinese patentgeneesmiddelen, negen geïmporteerde gezondheidsvoedingsmiddelen en 455 binnenlandse gezondheidsvoedingsmiddelen met EF als grondstof4. Dit medicinale materiaal heeft geweldige toepassingsperspectieven. In de afgelopen jaren zijn er echter steeds meer meldingen geweest van bijwerkingen en menselijke leverbeschadiging veroorzaakt door gezondheidsvoeding en Chinese patentgeneesmiddelen die EF als grondstof gebruiken, en gerelateerde toxiciteitsstudies 5,6,7 hebben gemeld dat EF als grondstof potentiële veiligheidsrisico’s met zich meebrengt.
Chinese medicinale verwerking verwijst naar farmaceutische technieken die de toxiciteit effectief kunnen verminderen of elimineren en de veiligheid van TCM’s kunnen verbeteren. De traditionele verwerkingsmethode van EF is roerbakken met schapenolie, wat de toxiciteit van EF vermindert en het effect ervan op het verwarmen van de nieren en het bevorderen van yang8 versterkt. Deze verwerkingsmethode is opgenomen in de Chinese Farmacopee en verschillende verwerkingsspecificaties1. Het proces van EF wordt alleen als volgt gespecificeerd: voor elke 100 kg EF wordt 20 kg vruchtwaterolie (geraffineerd) toegevoegd en het wordt mild gebakken tot uniform en glanzend1. Er zijn geen strikte EF-verwerkingsmethodeparameters in de bovenstaande normen, dus lokale verwerkingsspecificaties zijn niet geharmoniseerd om consistentie te bieden. Daarom zou het nuttig zijn om een systematische studie van het EF-proces uit te voeren. In dit artikel werd de Box-Behnken experimentele design-response oppervlaktemethode gebruikt om de verwerkingstechnologie van EF te optimaliseren.
Het experimentele ontwerp van Box-Behnken is een methode die meestal wordt gebruikt om de factoren in een proces te optimaliseren. De extractieparameters kunnen worden geoptimaliseerd door de functionele relatie tussen meerdere regressievergelijkingsaanpassingsfactoren en effectwaarden vast te stellen. Onlangs is deze methode op grote schaal gebruikt om TCM-extractie 5,6,7 en verwerking9,10,11 te bestuderen. Verschillende studies hebben TCM-bereidingsmethoden gemeld met betrekking tot zoutverwerking, wijnverwerking en roerbakken volgens een Box-Behnken-ontwerp, zoals voor met zout verwerkte Psoraleae fructus 12, wijnverwerkte Cnidii fructus13 en geroosterde Cinnamomi ramulus14. Deze methode heeft een kortere testtijd, een hoge testnauwkeurigheid en is geschikt voor multi-factor en multi-level tests. De methode is eenvoudiger dan de orthogonale ontwerptestmethode en uitgebreider dan de uniforme ontwerpmethode15. De verkregen relaties kunnen de voorspelde waarde van elk testpunt binnen het testbereik bepalen, wat een groot voordeel is. Een zebravismodel kan worden gebruikt om te testen of EF na verwerking minder giftig is.
In TCM-toxiciteitsstudies heeft het zebravismodel de dubbele voordelen van de hoge doorvoer van celexperimenten en de overeenkomsten met knaagdierexperimenten16. Dit model wordt gekenmerkt door zijn kleine formaat, hoge paaisnelheid, korte reproductiecyclus en gemak van fokken. Het model kan worden gebruikt in grootschalige synchrone experimenten in celkweekplaten, en de experimentele medicijndosering is klein, de experimentele cyclus is kort, de kosten zijn laag en het hele experimentele proces is gemakkelijk te observeren en te bedienen17. Zebravisembryo’s zijn transparant en ontwikkelen zich snel. Daarom kunnen de toxiciteit en teratogene effecten van geneesmiddelen op viscerale weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia direct worden waargenomen onder een microscoop18. De gen-homologie tussen zebravissen en mensen is zo hoog als 85%18. De signaaltransductieroute van zebravissen is vergelijkbaar met die van mensen18. De biologische structuur en fysiologische functie van zebravissen lijken sterk op die van zoogdieren18. Daarom kan een zebravismodel voor drugstests proefdieren bieden die betrouwbaar en volledig toepasbaar zijn op mensen19.
In deze studie gebruikten we de Box-Behnken design-response oppervlaktemethodologie om de hoeveelheid en temperatuur van schapenolie en de frituurtemperatuur die wordt gebruikt in de EF-verwerkingstechnologie te optimaliseren, met de inhoud van icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C en baohuoside I als de evaluatie-indexen. Het zebravismodel werd gebruikt om het effect van een EF-waterextract op de embryonale ontwikkeling van zebravissen voor en na de verwerking te onderzoeken om het verzwakkingseffect van verwerking op EF te evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onafhankelijke variabelen en de bepaling van hun niveaus
De EF-verwerkingstechnologie wordt alleen beschreven in de 2020-editie van de Chinese Farmacopee en de lokale Chinese medicijnverwerkingsspecificaties die zijn gepubliceerd door 26 provincies, gemeenten en autonome regio’s in het hele land1. De beschrijving omvat de volgende stappen: schapenolie nemen en verwarmen om te smelten, EF-snippers toevoegen, roerbakken met een langzaam vuur tot het uniform en glanzend is, het er…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door het Basic Scientific Research Business Project van de Chongqing Academy of Traditional Chinese Medicine (projectnummer: jbky20200013), het Performance Incentive Guidance Project van Chongqing Scientific Research Institutions (projectnummer: cstc2021jxjl 130025) en het Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project van Chinese Materia Medica Processing.
Materials
| Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside  (B ) |
Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
| Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
| Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
| Detector | Waters Corporation | 2998 | |
| Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
| Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
| Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
| Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
| Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
| Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
| High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
| Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
| Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
| Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
| Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
| Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
| Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
| Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
| Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
| Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
Riferimenti
- Chinese Pharmacopoeia Commission. . Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , (2020).
- Wang, X. T. . Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , (1998).
- Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. S. Advances in studies on processing mechanism of Epimedii Folium. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 12 (12), 2108-2111 (2010).
- Zhao, W., et al. Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design. Journal of The Science of Food and Agriculture. 91 (12), 2201-2209 (2011).
- Zhao, L. C., et al. The use of response surface methodology to optimize the ultrasound-assisted extraction of five anthraquinones from Rheum palmatum L. Molecules. 16 (7), 5928-5937 (2011).
- Mao, W. H., Han, L. J., Shi, B. Optimization of microwave assisted extraction of flavonoid from Radix Astragali using response surface methodology. Separation Science and Technology. 43 (12), 671-681 (2008).
- Liu, W., et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from Gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis. International Journal of Molecular Sciences. 11 (11), 4750-4763 (2010).
- Guo, G. L., et al. Research progress on processing mechanism of Epimedium fried with sheep fat oil based on warming kidney and promoting yang. Journal of Liaoning University of TCM. 22 (07), 1-5 (2020).
- Shen, X. J., Zhou, Q., Sun, L. -. L., Dai, Y. -. P., Yan, X. -. S. Optimization for cutting procedure of astragali radix with Box-Behnken design and response surface method. China Journal of Chinese Materia Medica. 39 (13), 2498-2503 (2014).
- Wang, L. H., et al. Optimization of processing technology of honey wheat bran based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 52 (12), 3538-3543 (2021).
- Zhang, J. B., et al. Study on integrated process of producing area and processing production for Paeoniae Radix Alba based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (18), 5657-5662 (2022).
- Li, N., Zhang, X. M., Yao, Y. Y., Chen, Y. L., Fan, Q. Optimization of processing technology for Psoraleae Fructus by D-optimal response surface methodology with UHPLC. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 39 (05), 42-44 (2022).
- Jia, Y. Q., et al. Optimization of processing technology with wine of Cnidii Fructus by AHP-entropy weight method combined with response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 10, 2338-2343 (2022).
- Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (08), 1838-1842 (2022).
- Wang, W. D., et al. Optimization extraction of effective constituents from Epimedii Herba based on central composite design-response surface methodology and orthogonal experimental design. Lishizhen Medicine and Materia Medica. 21 (11), 2766-2768 (2010).
- Yang, L., et al. Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals. Reproductive Toxicology. 28 (2), 245-253 (2009).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Jayasinghe, C. D., Jayawardena, U. A. Toxicity assessment of herbal medicine using zebrafish embryos: A systematic review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 7272808 (2019).
- Scholz, S. Zebrafish embryos as an alternative model for screening of drug induced organ toxicity. Archives of Toxicology. 87 (5), 767-769 (2013).
- Ling, J., et al. Analysis of Folium Epimedium toxicity in combination with Radix Morindae Officinalis based on zebrafish toxicity/metabolism synchronization. Acta Pharmaceutica Sinica. 53 (1), 74 (2018).
- Wang, Y., et al. Tri-n-butyl phosphate delays tissue repair by dysregulating neutrophil function in zebrafish. Toxicology and Applied Pharmacology. 449, 116114 (2022).
- Sheng, Z. L., Li, J. C., Li, Y. H. Optimization of forsythoside extraction from Forsythia suspensa by Box-Behnken design. African Journal of Biotechnology. 10 (55), 11728-11737 (2011).
- Pang, X., et al. Prenylated flavonoids and dihydrophenanthrenes from the leaves of Epimedium brevicornu and their cytotoxicity against HepG2 cells. Natural Product Research. 32 (19), 2253-2259 (2018).
- Zhong, R., et al. The toxicity and metabolism properties of Herba Epimedii flavonoids on laval and adult zebrafish. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 3745051 (2019).
- Zhang, L., et al. Effect of 2" -O-rhamnosyl icariside II, baohuoside I and baohuoside II in Herba Epimedii on cytotoxicity indices in HL-7702 and HepG2 cells. Molecules. 24 (7), 1263 (2019).
- Chen, Y., Yang, R. J., Yu, M., Ding, S. L., Chen, R. Q. Application of response surface methodology in modern production process optimization. Science & Technology Vision. 2016 (19), 36-39 (2016).
- Zhang, Y., et al. Progress in using zebrafish as a toxicological model for traditional Chinese medicine. Journal of Ethnopharmacology. 282, 114638 (2022).
- Oliveira, R., Domingues, I., Grisolia, C. K., Soares, A. M. V. M. Effects of triclosan on zebrafish early-life stages and adults. Environmental Science and Pollution Research. 16 (6), 679-688 (2009).
- Ton, C., Lin, Y., Willett, C. Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity testing. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (7), 553-567 (2006).
- He, Q., et al. Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos. Drug and Chemical Toxicology. 35 (2), 149-154 (2012).
- Chen, Y., et al. Developmental toxicity of muscone on zebrafish embryos. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology. (6), 267-273 (2014).
- He, Y. L., et al. Effects of shikonin on zebrafish’s embryo and angiogenesis. Chinese Traditional Patent Medicine. 38 (2), 241-245 (2016).
- Zhou, Y. . The transformation research on the chemical compositions in the processing of Epimedium. , (2016).
- Xiao, Y. P., Zeng, J., Jiao, L. -. N., Xu, X. -. Y. Review for treatment effect and signaling pathway regulation of kidney-tonifying traditional Chinese medicine on osteoporosis. China Journal of Chinese Materia Medica. 43 (1), 21-30 (2018).
- Wang, R. H. Study on modern pharmacological effects of traditional Chinese medicine for tonifying kidney yang. Journal of Hubei University of Chinese Medicine. 13 (04), 63-66 (2011).
- Luo, L., et al. Advances in the chemical constituents and pharmacological studies of Epimedium. Asia-Pacific Traditional Medicine. 15 (6), 190-194 (2019).
- Liu, S., et al. Effects of icariin on ERβ gene expression and serum estradiol level in ovariectomized rats. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 32 (1), 150-152 (2016).
- Liu, Y., et al. Effects of epimedin A on osteoclasts and osteoporotic male mice. Chinese Journal of Veterinary Science. 41 (07), 1359-1364 (2021).
- Liu, Y. L., et al. Effects of icariin and epimedium C on microstructure of bone tissue in glucocorticoid osteoporosis model mice based on Micro-CT technique. Drug Evaluation Research. 43 (09), 1733-1739 (2020).
- Zhan, Y. Evaluation of antiosteoporotic activity for micro amount icariin and epimedin B based on the osteoporosis model using zebrafish. Chinese Pharmaceutical Journal. (24), 30-35 (2014).
- Zhan, Y., Wei, Y. -. J., Sun, E., Xu, F. -. J., Jia, X. -. B. Two-dimensional zebrafish model combined with hyphenated chromatographic techniques for evaluation anti-osteoporosis activity of epimendin A and its metabolite baohuoside I. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (06), 932-937 (2014).
