In dit protocol werd de schapenolieverwerkingstechnologie van Epimedii folium (EF) geoptimaliseerd door een Box-Behnken experimentele ontwerp-respons oppervlaktemethodologie toe te passen, en het effect van ruwe en geoptimaliseerde watergeëxtraheerde EF op de embryonale ontwikkeling van zebravissen werd voorlopig onderzocht.
Als een traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft Epimedii folium (EF) een geschiedenis in geneeskunde en voedsel die > 2.000 jaar oud is. Klinisch wordt EF verwerkt met schapenolie vaak gebruikt als geneesmiddel. In de afgelopen jaren zijn de meldingen van veiligheidsrisico’s en bijwerkingen van producten die EF als grondstof gebruiken geleidelijk toegenomen. Verwerking kan de veiligheid van TCM effectief verbeteren. Volgens de TCM-theorie kan de verwerking van schapenolie de toxiciteit van EF verminderen en het tonificerende effect op de nieren versterken. Er is echter een gebrek aan systematisch onderzoek en evaluatie van EF-technologie voor de verwerking van schapenolie. In deze studie gebruikten we de Box-Behnken experimentele ontwerp-respons oppervlaktemethodologie om de belangrijkste parameters van de verwerkingstechnologie te optimaliseren door de inhoud van meerdere componenten te beoordelen. De resultaten toonden aan dat de optimale verwerking van schapenolie van EF als volgt was: de schapenolie verwarmen bij 120 °C ± 10 °C, de ruwe EF toevoegen, voorzichtig roerbakken tot 189 °C ± 10 °C totdat deze gelijkmatig glanzend is, en vervolgens verwijderen en afkoelen. Voor elke 100 kg EF moet 15 kg schapenolie worden gebruikt. De toxiciteiten en teratogeniciteiten van een waterig extract van ruwe en schapenolie verwerkte EF werden vergeleken in een zebravisembryo-ontwikkelingsmodel. De resultaten toonden aan dat de ruwe kruidengroep meer kans had om zebravismisvormingen te veroorzaken en dat de half-maximale dodelijke EF-concentratie lager was. Kortom, de geoptimaliseerde schapenolieverwerkingstechnologie was stabiel en betrouwbaar, met een goede herhaalbaarheid. Bij een bepaalde dosis was het waterige extract van EF giftig voor de ontwikkeling van zebravisembryo’s en de toxiciteit was sterker voor het ruwe medicijn dan voor het verwerkte medicijn. De resultaten toonden aan dat de verwerking van schapenolie de toxiciteit van ruwe EF verminderde. Deze bevindingen kunnen worden gebruikt om de kwaliteit, uniformiteit en klinische veiligheid van met schapenolie verwerkte EF te verbeteren.
Epimedii folium (EF) is het gedroogde blad van Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., of Epimedium koreanum Nakai. EF kan worden gebruikt voor de behandeling van osteoporose, menopauzale syndroom, borstknobbels, hypertensie, coronaire hartziekten en andere ziekten1. Als traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft EF een geschiedenis in geneeskunde en voedsel van meer dan 2.000 jaar. Vanwege de lage prijs en het opmerkelijke effect van tonificatie van de nieren, wordt het veel gebruikt in medicijnen en gezonde voedingsmiddelen. EF wordt verwerkt door het te roerbakken met schapenolie, een proces dat voor het eerst werd beschreven in Lei Gong Processing Theory geschreven door Lei Xiao in de Liu Song-periode2. De werkzaamheid van ruwe EF en roergebakken EF is heel verschillend. Ruwe EF verdrijft voornamelijk reuma, terwijl de gewokte EF de nieren verwarmt om yang3 te versterken. Op dit moment wordt EF veel gebruikt als grondstof in geneesmiddelen en gezonde voedingsmiddelen; er zijn 399 beursgenoteerde Chinese patentgeneesmiddelen, negen geïmporteerde gezondheidsvoedingsmiddelen en 455 binnenlandse gezondheidsvoedingsmiddelen met EF als grondstof4. Dit medicinale materiaal heeft geweldige toepassingsperspectieven. In de afgelopen jaren zijn er echter steeds meer meldingen geweest van bijwerkingen en menselijke leverbeschadiging veroorzaakt door gezondheidsvoeding en Chinese patentgeneesmiddelen die EF als grondstof gebruiken, en gerelateerde toxiciteitsstudies 5,6,7 hebben gemeld dat EF als grondstof potentiële veiligheidsrisico’s met zich meebrengt.
Chinese medicinale verwerking verwijst naar farmaceutische technieken die de toxiciteit effectief kunnen verminderen of elimineren en de veiligheid van TCM’s kunnen verbeteren. De traditionele verwerkingsmethode van EF is roerbakken met schapenolie, wat de toxiciteit van EF vermindert en het effect ervan op het verwarmen van de nieren en het bevorderen van yang8 versterkt. Deze verwerkingsmethode is opgenomen in de Chinese Farmacopee en verschillende verwerkingsspecificaties1. Het proces van EF wordt alleen als volgt gespecificeerd: voor elke 100 kg EF wordt 20 kg vruchtwaterolie (geraffineerd) toegevoegd en het wordt mild gebakken tot uniform en glanzend1. Er zijn geen strikte EF-verwerkingsmethodeparameters in de bovenstaande normen, dus lokale verwerkingsspecificaties zijn niet geharmoniseerd om consistentie te bieden. Daarom zou het nuttig zijn om een systematische studie van het EF-proces uit te voeren. In dit artikel werd de Box-Behnken experimentele design-response oppervlaktemethode gebruikt om de verwerkingstechnologie van EF te optimaliseren.
Het experimentele ontwerp van Box-Behnken is een methode die meestal wordt gebruikt om de factoren in een proces te optimaliseren. De extractieparameters kunnen worden geoptimaliseerd door de functionele relatie tussen meerdere regressievergelijkingsaanpassingsfactoren en effectwaarden vast te stellen. Onlangs is deze methode op grote schaal gebruikt om TCM-extractie 5,6,7 en verwerking9,10,11 te bestuderen. Verschillende studies hebben TCM-bereidingsmethoden gemeld met betrekking tot zoutverwerking, wijnverwerking en roerbakken volgens een Box-Behnken-ontwerp, zoals voor met zout verwerkte Psoraleae fructus 12, wijnverwerkte Cnidii fructus13 en geroosterde Cinnamomi ramulus14. Deze methode heeft een kortere testtijd, een hoge testnauwkeurigheid en is geschikt voor multi-factor en multi-level tests. De methode is eenvoudiger dan de orthogonale ontwerptestmethode en uitgebreider dan de uniforme ontwerpmethode15. De verkregen relaties kunnen de voorspelde waarde van elk testpunt binnen het testbereik bepalen, wat een groot voordeel is. Een zebravismodel kan worden gebruikt om te testen of EF na verwerking minder giftig is.
In TCM-toxiciteitsstudies heeft het zebravismodel de dubbele voordelen van de hoge doorvoer van celexperimenten en de overeenkomsten met knaagdierexperimenten16. Dit model wordt gekenmerkt door zijn kleine formaat, hoge paaisnelheid, korte reproductiecyclus en gemak van fokken. Het model kan worden gebruikt in grootschalige synchrone experimenten in celkweekplaten, en de experimentele medicijndosering is klein, de experimentele cyclus is kort, de kosten zijn laag en het hele experimentele proces is gemakkelijk te observeren en te bedienen17. Zebravisembryo’s zijn transparant en ontwikkelen zich snel. Daarom kunnen de toxiciteit en teratogene effecten van geneesmiddelen op viscerale weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia direct worden waargenomen onder een microscoop18. De gen-homologie tussen zebravissen en mensen is zo hoog als 85%18. De signaaltransductieroute van zebravissen is vergelijkbaar met die van mensen18. De biologische structuur en fysiologische functie van zebravissen lijken sterk op die van zoogdieren18. Daarom kan een zebravismodel voor drugstests proefdieren bieden die betrouwbaar en volledig toepasbaar zijn op mensen19.
In deze studie gebruikten we de Box-Behnken design-response oppervlaktemethodologie om de hoeveelheid en temperatuur van schapenolie en de frituurtemperatuur die wordt gebruikt in de EF-verwerkingstechnologie te optimaliseren, met de inhoud van icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C en baohuoside I als de evaluatie-indexen. Het zebravismodel werd gebruikt om het effect van een EF-waterextract op de embryonale ontwikkeling van zebravissen voor en na de verwerking te onderzoeken om het verzwakkingseffect van verwerking op EF te evalueren.
Onafhankelijke variabelen en de bepaling van hun niveaus
De EF-verwerkingstechnologie wordt alleen beschreven in de 2020-editie van de Chinese Farmacopee en de lokale Chinese medicijnverwerkingsspecificaties die zijn gepubliceerd door 26 provincies, gemeenten en autonome regio’s in het hele land1. De beschrijving omvat de volgende stappen: schapenolie nemen en verwarmen om te smelten, EF-snippers toevoegen, roerbakken met een langzaam vuur tot het uniform en glanzend is, het er…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door het Basic Scientific Research Business Project van de Chongqing Academy of Traditional Chinese Medicine (projectnummer: jbky20200013), het Performance Incentive Guidance Project van Chongqing Scientific Research Institutions (projectnummer: cstc2021jxjl 130025) en het Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project van Chinese Materia Medica Processing.
Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside (B ) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
Detector | Waters Corporation | 2998 | |
Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |