Изоляция эндотелиальных клеток подкожных вен человека и воздействие контролируемых уровней напряжения сдвига и растяжения
Summary
Мы описываем протокол выделения и культивирования эндотелиальных клеток подкожной вены человека (hSVECs). Мы также предлагаем подробные методы получения напряжения сдвига и растяжения для изучения механического напряжения в hSVEC.
Abstract
Аортокоронарное шунтирование (АКШ) – это процедура реваскуляризации ишемического миокарда. Подкожная вена по-прежнему используется в качестве канала АКШ, несмотря на сниженную долгосрочную проходимость по сравнению с артериальными каналами. Резкое увеличение гемодинамического напряжения, связанного с артериализацией трансплантата, приводит к повреждению сосудов, особенно эндотелия, что может влиять на низкую проходимость трансплантата подкожной вены (SVG). Здесь мы описываем выделение, характеристику и расширение эндотелиальных клеток подкожных вен человека (hSVEC). Клетки, выделенные с помощью коллагеназного расщепления, демонстрируют типичную морфологию булыжника и экспрессируют маркеры эндотелиальных клеток CD31 и VE-кадгерин. Чтобы оценить влияние механического напряжения, в этом исследовании были использованы протоколы для исследования двух основных физических стимулов, напряжения сдвига и растяжения, на артериализированных SVG. hSVEC культивируют в проточной камере с параллельной пластиной для создания напряжения сдвига, демонстрируя выравнивание в направлении потока и повышенную экспрессию KLF2, KLF4 и NOS3. hSVEC также можно культивировать в кремниевой мембране, которая позволяет контролировать клеточное растяжение, имитирующее венозное (низкое) и артериальное (высокое) растяжение. F-актиновый паттерн эндотелиальных клеток и секреция оксида азота (NO) модулируются соответственно артериальным растяжением. Таким образом, мы представляем подробный метод выделения hSVEC для изучения влияния гемодинамического механического стресса на фенотип эндотелия.
Introduction
Дисфункция эндотелиальных клеток (ЭК) является ключевым фактором в недостаточности трансплантата подкожной вены 1,2,3,4. Устойчивое увеличение напряжения сдвига и циклического растяжения индуцирует провоспалительный фенотип эндотелиальных клеток подкожной вены человека (hSVECs)3,4,5,6. Основные молекулярные пути до сих пор не полностью поняты, и стандартизированные протоколы для исследований in vitro могут использовать усилия для новых идей в этой области. Здесь мы описываем простой протокол для выделения, характеристики и расширения hSVEC и то, как подвергать их различным уровням напряжения сдвига и циклического растяжения, имитируя венозные и артериальные гемодинамические состояния.
hSVEC выделяются путем инкубации коллагеназы и могут использоваться до пассажа 8. Этот протокол требует меньшего количества манипуляций с сосудом по сравнению с другими доступными протоколами7, что снижает загрязнение гладкомышечными клетками и фибробластами. С другой стороны, для эффективного извлечения ЕС требуется больший сегмент сосуда не менее 2 см. В литературе сообщалось, что ЭК из крупных сосудов также могут быть получены путем механического удаления 7,8. Несмотря на эффективность, физический подход имеет недостатки, заключающиеся в низком выходе EC и более высокой контаминации фибробластов. Для повышения чистоты необходимы дополнительные шаги с использованием магнитных шариков или сортировки клеток, что увеличивает стоимость протокола из-за приобретения шариков и антител 7,8. Ферментативный метод дает более быстрые и лучшие результаты в отношении чистоты и жизнеспособности ЕС 7,8.
Наиболее часто используемыми ЭК для изучения эндотелиальной дисфункции являются эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). Известно, что фенотип ЭК изменяется в разных сосудистых руслах, и необходимо разработать методы, представляющие исследуемый сосуд 9,10. В этом отношении создание протокола для выделения hSVEC и культивирования его в условиях механического стресса является ценным инструментом для понимания вклада дисфункции hSVEC в заболевание венозного трансплантата.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сегмент подкожной вены должен быть не менее 2 см для успешной изоляции hSVEC. Небольшие сегменты трудно обрабатывать и связывать концы сосуда для поддержания раствора коллагеназы для изоляции клеток. Уменьшенная площадь поверхности просвета не дает достаточного количества клеток для ра…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JEK поддерживается грантами Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 и 2013/17368-0] и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 и 309179/2013-0). AAM поддерживается грантами Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal – 407911/2021-9).
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
Riferimenti
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
- Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
- Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
- Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
- Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
- Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
- Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
- Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
- Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
- Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
- Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).
