Summary
Qui, dimostriamo l'uso dell'impedenza elettrica basata su cellule (CEI) come metodo molto semplice e diretto per studiare l'infezione e la replicazione del virus Zika nelle cellule umane in tempo reale. Inoltre, il saggio CEI è utile per la valutazione di composti antivirali.
Abstract
La tecnologia di impedenza elettrica basata su celle (CEI) misura i cambiamenti di impedenza causati da un monostrato di cellule aderenti in crescita o manipolato su pozzetti a piastre di coltura incorporati con elettrodi. La tecnologia può essere utilizzata per monitorare le conseguenze dell'infezione da virus Zika (ZIKV) e la replicazione cellulare aderente in tempo reale, poiché questo virus è altamente citopatogeno. È un test semplice che non richiede l'uso di etichette o metodi invasivi e ha il vantaggio di fornire dati in tempo reale. La cinetica dell'infezione da ZIKV dipende fortemente dalla linea cellulare impiegata, dal ceppo virale e dalla molteplicità dell'infezione (MOI), che non può essere facilmente studiata con i test convenzionali degli endpoint. Inoltre, il test CEI può essere utilizzato anche per la valutazione e la caratterizzazione di composti antivirali, che possono avere anche proprietà inibitorie dinamiche nel corso dell'infezione. Questo articolo sui metodi fornisce una spiegazione dettagliata dell'esecuzione pratica del saggio CEI e delle sue potenziali applicazioni nella ricerca ZIKV e nella ricerca antivirale in generale.
Introduction
I focolai di virus Zika (ZIKV) sono associati a gravi complicanze della malattia, come la microcefalia e la sindrome di Guillain-Barre 1,2,3. Sebbene le future epidemie siano plausibili a causa di vari fattori di rischio come la diffusione della distribuzione dei vettori delle zanzare e la crescente urbanizzazione, ad oggi, nessun vaccino o farmaco antivirale è ancora arrivato sul mercato 3,4. Pertanto, i metodi di ricerca tradizionali ZIKV dovrebbero essere integrati con nuovi strumenti per studiare questo virus e i suoi potenziali composti antivirali. La ricerca antivirale si basa spesso su saggi fenotipici, in cui l'endpoint è la presenza di un parametro specifico, come la comparsa di un effetto citopatico indotto da virus (CPE) o la produzione di una particolare proteina indotta da virus per mezzo di un gene reporter 5,6,7. Tuttavia, questi metodi hanno letture degli endpoint, sono laboriosi e possono richiedere analisi complesse. Pertanto, i metodi basati sull'impedenza offrono un'alternativa interessante.
L'impedenza elettrica basata su celle (CEI) è definita come la resistenza al flusso di corrente da un elettrodo all'altro, causata da uno strato cellulare aderente seminato su pozzetti contenenti elettrodi. La consolidata tecnologia CEI impiegata in questa metodologia è Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS), originariamente sviluppata da Giaever e Keese 8,9. Questo è usato in un ampio campo di domini di ricerca biologica, come metastasi del cancro, tossicologia e guarigione delle ferite10,11,12. Il suo principio si basa su un campo elettrico generato da un continuo spazzamento di tensioni di corrente alternata (CA) su un intervallo di frequenze13. Le cellule sono esposte a questi campi elettrici non invasivi e, a intervalli predeterminati, vengono misurati i cambiamenti di impedenza causati dalla crescita cellulare o dai cambiamenti nell'aderenza o nella morfologia cellulare14. Inoltre, l'alterata vitalità cellulare porta anche a cambiamenti di impedenza, rendendo la tecnologia uno strumento utile per monitorare l'infezione da virus citopatogeni15,16,17. Poiché i cambiamenti morfologici dello strato cellulare saranno rilevati su scala nanometrica, la tecnologia offre uno strumento di rilevamento altamente sensibile. Il test CEI descritto in questo articolo è un metodo semplice, non invasivo, in tempo reale, label-free per misurare le variazioni di impedenza dello strato cellulare nel tempo.
Sebbene la CEI non sia stata utilizzata per valutare il decorso dell'infezione da ZIKV o i suoi potenziali antivirali, il suo uso come strumento diagnostico è stato studiato prima del18. In un recente studio, l'uso del saggio CEI per determinare l'attività antivirale di diversi inibitori ZIKV nelle cellule A549 è stato validato per la prima volta19. Questo articolo sui metodi descrive questo test CEI in modo più dettagliato e lo espande a varie linee cellulari aderenti, nonché a una varietà di ceppi ZIKV a varie molteplicità di infezione (MOI). In questo modo, viene dimostrato l'uso versatile di questo metodo nella ricerca antivirale sui flavivirus. Il metodo ha il vantaggio cruciale del monitoraggio cellulare in tempo reale, che consente il rilevamento di importanti punti temporali di infezione e l'attività di inibizione dinamica da parte di potenziali composti antivirali. Nel loro insieme, la tecnologia CEI offre uno strumento potente e prezioso per integrare l'attuale gamma di metodologie antivirali.
Protocol
Tutte le fasi descritte vengono eseguite in condizioni sterili in un armadio a flusso laminare di un laboratorio di livello 2 di biosicurezza. Tutti i virus utilizzati sono stati ottenuti e utilizzati come approvati, secondo le regole di un comitato di revisione istituzionale belga (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protocollo FFS 219 2011/0011) e del Comitato per la biosicurezza presso l'KU Leuven.
1. Mantenimento della coltura cellulare
NOTA: Questo protocollo viene eseguito con una selezione di linee cellulari, ma può ovviamente essere adattato a qualsiasi linea cellulare aderente, richiedendo solo l'ottimizzazione della densità di semina cellulare.
- Far crescere la linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano A549, la linea cellulare di glioblastoma maligno umano U87 e le cellule di fibroblasti polmonari embrionali umani HEL 299 in flaconi di coltura T75 a 37 °C e 5% di CO2 in un incubatore umidificato.
- Sottocoltura delle cellule all'80% -95% di confluenza. Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente (RT) prima di coltivare le cellule.
- Rimuovere il terreno di coltura condizionato dalle cellule. Utilizzare 5 ml di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) per lavare il monostrato cellulare una volta.
- Distribuire 1 mL di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico allo 0,25% (EDTA) uniformemente sul monostrato cellulare. Quindi, incubare per un massimo di 3 minuti a 37 °C fino a quando le cellule iniziano a staccarsi.
- Aggiungere 9 ml di terreno di coltura fresco e completo (vedere la tabella dei materiali per i dettagli). Pipet delicatamente su e giù per risospendere le cellule.
- Trasferire il volume desiderato di sospensione cellulare in un nuovo matraccio di coltura T75 e aggiungere un volume appropriato di terreno di coltura fresco per ottenere un volume totale di 15 ml.
NOTA: Le linee cellulari in vitro utilizzate in questo protocollo sono subcoltivate in diluizioni da 1:4 a 1:10, a seconda della specifica linea cellulare, per consentire condizioni di crescita ideali. Le sottocolture vengono eseguite ogni 3-4 giorni, quindi il volume di sospensione cellulare desiderato può anche variare in base al numero di giorni di incubazione.
2. Preparazione della targa CEI
- Prendi una piastra da 96 pozzetti con elettrodi interdigitati (vedi Tabella dei materiali) e riempi tutti i pozzetti con 100 μL di terreno di coltura di crescita.
- Riempi gli spazi tra i pozzi con DPBS.
NOTA: Questo viene fatto per ridurre l'effetto bordo dovuto all'evaporazione che si osserva quando si coltivano le cellule in piastre a 96 pozzetti. - Incubare la piastra per 4 ore a 37 °C in un incubatore con il 5% di CO2.
3. Semina delle cellule
- Staccare le cellule dal matraccio di coltura, come descritto nel paragrafo 1, e risospenderle in un terreno di coltura fresco in una provetta da 50 ml.
- Contare il numero di cellule vitali usando il metodo di scelta.
NOTA: Nel caso delle celle A549, la vitalità raggiunge generalmente ~ 100%. Per determinare il numero di cellule, utilizziamo un sistema automatizzato di analisi cellulare basato sulla colorazione con arancia acridina/ioduro di propidio (vedi Tabella dei materiali). Altri metodi di conteggio delle celle funzionano altrettanto bene. - Risospendere le cellule in terreno di crescita fresco per ottenere la densità cellulare desiderata. In questo studio, la densità cellulare ottimale di A549 è 0,15 × 106 (vitali) cellule / ml.
- Estrarre la piastra a 96 pozzetti con elettrodi interdigitati dall'incubatore e rimuovere il mezzo con un pipet multicanale.
- Erogare 100 μL della sospensione cellulare (corrispondenti a 15 × 103 cellule in questo caso) per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti.
- Lasciare che le celle si equilibrino per 15 minuti a temperatura ambiente prima di inserirle nel dispositivo CEI.
4. Impostazione e funzionamento del saggio CEI
- Posizionare l'incubatore che ospita il portapiastre del dispositivo CEI a 37 °C e 5% CO2.
- Posizionare la piastra a 96 pozzetti nel dispositivo.
- Apri il software del dispositivo e configura un nuovo esperimento facendo clic su Configurazione nel riquadro Raccogli dati. Attendere che il portatile si colleghi al dispositivo ECIS e configurare la piastra controllando le impedenze dei pozzi. Controllare se tutti i pozzetti sono configurati correttamente, come indicato da un colore verde. In caso contrario, ripetere il passaggio 4.2 fino a quando tutti i pozzetti sono verdi.
- Nel riquadro Configurazione pozzo, selezionare il tipo di matrice, in base al software della lingua utilizzato.
- Selezionare la modalità Frequenza/Tempo multipli.
NOTA: in questa modalità, il dispositivo misura le variazioni di impedenza in un intervallo di frequenze. - Avviare la misurazione facendo clic su Avvia.
NOTA: l'impedenza in tempo reale può essere monitorata sull'interfaccia del software. Selezionare la frequenza desiderata da visualizzare. In questo esempio viene scelto 16 kHz.
5. Preparazione e incubazione del composto
NOTA: Come esempio di un composto antivirale, viene utilizzato labyrinthopeptin A1 (vedere la tabella dei materiali). Poiché questo protocollo può essere generalizzato a tutti i composti con potenziale attività antivirale, ci riferiamo ad esso come "il composto".
- Consentire un terreno di coltura cellulare completo senza l'aggiunta di siero bovino fetale (FBS) (denominato "tampone di analisi") per equilibrarsi a RT.
- Mantenere i composti sul ghiaccio.
- Preparare una diluizione concentrata 10x di ciascun composto in mezzo di analisi in provette di polipropilene da 5 ml.
- Diluire serialmente i composti in mezzo di analisi in provette di polipropilene da 5 mL per ottenere le concentrazioni desiderate di 10x.
- Sospendere il dispositivo CEI facendo clic su Sospendi nel riquadro Impostazioni raccolta dati. Attendere il completamento del punto temporale corrente ed estrarre la piastra a 96 pozzetti.
- Verificare l'aderenza e la formazione monostrato delle cellule al microscopio ottico.
- Rimuovere 20 μL da ciascun pozzetto con un pipet multicanale.
- Aggiungere 20 μL di soluzione composta o veicolo nei pozzetti desiderati. Preparare un layout con le condizioni specifiche per il pipettaggio corretto.
- Incubare la piastra per 15 minuti a 37 °C con il 5% di CO2.
NOTA: Per questa fase di incubazione viene utilizzato un normale incubatore cellulare anziché un dispositivo CEI. I pozzetti di controllo cellulare (CC) sono pozzi trattati con veicoli.
6. Preparazione del virus e infezione
- Scongelare una fiala di stock di virus. In questo esempio vengono utilizzati ZIKV MR766 e ZIKV PRVABC59.
- Preparare diluizioni virali al MOI desiderato o diluizioni in mezzo di analisi in un tubo di polipropilene da 15 ml.
Nota : in questo esempio rappresentativo vengono utilizzati MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 e 0.00005. - Aggiungere 100 μL di diluizione del virus nei pozzetti assegnati della piastra a 96 pozzetti. Aggiungere il mezzo di analisi ai pozzetti CC.
- Decontaminare i contenitori di virus impiegati.
- Rimettere la piastra nel dispositivo CEI e continuare le misurazioni per 6 giorni consecutivi facendo clic su Riprendi esperimento.
NOTA: i pozzetti di controllo del virus (VC) sono cellule infette trattate con veicoli, mentre nei pozzetti CC viene aggiunto il mezzo di analisi anziché la diluizione del virus. Se viene valutata la citotossicità dei composti, aggiungere 100 μL di tampone di dosaggio invece della diluizione del virus.
7. Analisi dei dati
- Termina l'esperimento facendo clic su Fine e aggiungi commenti di riepilogo facoltativi, ad esempio informazioni sulle condizioni sperimentali specifiche nella finestra visualizzata. Fare clic su OK al termine della raccolta dati.
- Selezionare la frequenza desiderata nel riquadro Grafico in cui alla fine dell'esperimento viene misurata la maggiore differenza di impedenza tra CC e VC.
- Per determinare la frequenza migliore, eseguire un esperimento pilota con cellule non infette e infette e scegliere la frequenza che, nel momento in cui l'impedenza delle cellule infette è scesa al livello basale, porta alla più grande differenza di impedenza osservata tra le cellule non infette e infette. Nel caso delle cellule A549 infette da ZIKV, questo è 16 kHz.
- Per esportare tutti i dati in formato foglio di calcolo, assicurarsi che tutti i pozzi siano selezionati nel riquadro Configurazione pozzo e fare clic su File | Esportazione dei dati | Dati grafici.
- Normalizzare i dati sottraendo il valore medio di impedenza VC misurato alla fine dell'esperimento da tutti i punti dati e dividendolo per il valore medio di impedenza CC dell'ultimo punto temporale misurato prima dell'infezione.
- Tracciare i dati normalizzati in funzione del tempo per ottenere grafici di profilo CEI.
- Calcolare l'area normalizzata sotto la curva (AUCn) di ciascuna condizione per determinare parametri come le concentrazioni inibitorie del 50% (IC50).
- Calcola altri parametri utili, come CIT50, per, ad esempio, confrontare l'infettività di vari ceppi virali.
Representative Results
In questo articolo, l'uso del saggio CEI nella ricerca ZIKV è descritto in dettaglio. Il flusso di lavoro di questo test è illustrato nella Figura 1. Dimostriamo la convenienza del monitoraggio in tempo reale dell'infezione da ZIKV in un tipo di cellula desiderato, nonché la valutazione dell'inibizione dell'infezione da parte di un composto antivirale. Come esempio antivirale, usiamo il peptide ben descritto labyrinthopeptin A1 (Laby A1); Ci riferiamo a questo come "il composto", poiché le sue proprietà specifiche vanno oltre lo scopo di questo articolo sui metodi e sono discusse altrove20,21. Da notare che la riproducibilità del metodo non è discussa nella sezione dei risultati, poiché vogliamo concentrarci sui singoli profili di impedenza ottenuti utilizzando la metodologia. Tuttavia, questo è stato descritto in precedenza19.
Nella prima serie di esperimenti, dimostriamo l'importanza dell'ottimizzazione della densità cellulare quando si eseguono saggi di infezione CEI (Figura 2). Quando vengono seminate troppe cellule, il monostrato cellulare sarà completamente cresciuto e non sarà in grado di diffondersi ulteriormente attraverso gli elettrodi CEI. Ciò porta a una minore differenza tra CC e VC, e quindi a una risoluzione inferiore, diminuendo la finestra di rilevamento dell'attività antivirale. Questo è ben esemplificato nella Figura 2E. Per alcuni tipi di cellule più grandi, come le celle U87, seminare cellule troppo densamente potrebbe persino portare al completo distacco del monostrato cellulare durante la manipolazione della piastra, come dimostrato qui (Figura 2F). Questo è anche osservato al microscopio.
La Figura 2 dimostra anche che il test è molto utile per eseguire studi di suscettibilità cellulare. Dalla figura 2A,B emerge chiaramente che la cinetica dell'infezione dipende fortemente dal tipo di cellula. La Figura 2C dimostra che le cellule U87 sono suscettibili all'infezione da ZIKV solo con MOI elevati.
Nella seconda serie di esperimenti, l'uso versatile del test di infezione CEI è evidenziato utilizzando vari ceppi ZIKV in diversi MOI e in presenza di un composto antivirale ben descritto (Figura 3). Questi esperimenti sono eseguiti con cellule A549, un modello comunemente usato nella ricerca sui flavivirus22,23. Questa linea cellulare è stata utilizzata anche in altri studi che ne hanno dimostrato l'idoneità nei saggi CEI24. In primo luogo, la cinetica di infezione da parte di un ceppo rappresentativo ZIKV del lignaggio africano MR766, viene confrontata con quella del lignaggio asiatico PRVABC59. La Figura 3A dimostra che entrambi i ceppi hanno modelli CEI comparabili, con PRVABC59 che ha proprietà di induzione CPE leggermente più lente. Ciò si riflette anche nei valori CIT50 (Figura 3B). Questo interessante parametro è stato introdotto per la prima volta da Fang et al.16 e tiene conto della cinetica delle misure CEI. È definito come il tempo necessario per ridurre l'impedenza del 50% rispetto al controllo della cella.
Successivamente, le cellule sono state infettate con tre diversi MOI di ZIKV MR766 o PRVABC59, in presenza o assenza di varie concentrazioni di composti, e i profili di impedenza sono stati monitorati. Come si può osservare dalla Figura 3C-H, alcune concentrazioni di composti inibiscono o ritardano la caduta di impedenza causata dall'infezione da ZIKV. Ciò si riflette anche quando vengono calcolati i valori AUC. I risultati del test CEI dimostrano anche visivamente che l'attività antivirale dipende dal MOI e dal punto temporale della valutazione della potenza. I calcoli AUCn possono essere utilizzati per determinare i valori IC50, come illustrato nella figura 3I. Infine, la figura 3H mostra che i valori CIT50 possono essere utilizzati anche per determinare e confrontare le potenze composte. I composti inattivi o le concentrazioni di composti sono caratterizzati da profili CEI, AUC e valori di CIT50 paragonabili a quelli di VC.
Figura 1: Panoramica schematica del flusso di lavoro del test. La cronologia e le diverse fasi di manipolazione e incubazione del test CEI sono rappresentate qui. Abbreviazioni: CEI = impedenza elettrica basata su celle; ZIKV = virus Zika; D = giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Profili CEI normalizzati di cellule infette da ZIKV a diverse densità. (A,D) A549, (B,E) HEL 299, o (C,F) Le cellule U87 sono state seminate a (A-C) 15.000-20.000 ("ottimale") o (D-F) 75.000 ("subottimale") cellule per pozzetto in una piastra CEI a 96 pozzetti. Dopo 24 ore di monitoraggio dell'impedenza, le cellule sono state infettate con diluizioni MOI dieci volte superiori di ZIKV MR766. L'impedenza è stata ulteriormente monitorata per 5 giorni consecutivi. Vengono mostrati i profili CEI (media ± intervallo di due repliche tecniche) di un esperimento rappresentativo. Abbreviazioni: CEI = impedenza elettrica basata su celle; MOI = molteplicità dell'infezione; ZIKV = virus Zika; Norma = normalizzato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Profili CEI normalizzati delle cellule A549 dopo infezione con due ceppi ZIKV e inibizione da parte di un composto antivirale. (A) Le cellule A549 aderenti sono state infettate con vari MOI di ZIKV MR766 o ZIKV PRVABC59 e l'impedenza è stata monitorata continuamente. Viene mostrata la media ± SD di tre repliche tecniche di un esperimento rappresentativo. (B) I valori CIT50 sono stati calcolati sulla base del profilo CEI di A e confrontati. Viene mostrata la media ± SD di tre repliche tecniche eseguite. (C-H) Le cellule A549 aderenti sono state trattate con varie concentrazioni di composti e successivamente infettate con un MOI specifico di ZIKV MR766 (C-E) o ZIKV PRVABC59 (F-H). L'impedenza è stata continuamente monitorata. Viene mostrato l'intervallo medio ± di due repliche tecniche di un esperimento rappresentativo. (I) Per confrontare l'inibizione del composto con diversi ceppi e diluizioni ZIKV, è stata calcolata l'AUC n e le percentuali inibitorie sono state determinate sottraendo tutte le condizioni per l'AUC n del CC e dividendo per l'AUCn diVC. (J) I valori CIT50 dell'esperimento mostrato in C-H sono stati calcolati per confrontare i diversi ceppi ZIKV e MOI. Viene mostrato ±intervallo medio di due repliche tecniche. Abbreviazioni: CEI = impedenza elettrica basata su celle; MOI = molteplicità dell'infezione; ZIKV = virus Zika; Norma = normalizzato; CIT 50 = tempo in cui l'impedenza è diminuita del50% rispetto al controllo non trattato; AUC = area sotto la curva; CC = controllo cellulare; VC = controllo dei virus. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussion
Questo articolo descrive l'uso del test CEI nella ricerca antivirale ZIKV. Il test ha il vantaggio del monitoraggio in tempo reale e può quindi essere utilizzato per valutare la cinetica dell'infezione da ZIKV e l'inibizione antivirale con composti selettivi. I dati ottenuti con questo metodo consentono un'osservazione oggettiva e visiva della CPE indotta dal virus e della potenza di un potenziale composto antivirale.
Poiché la CEI è un metodo molto sensibile, è necessario prestare molta attenzione quando si esegue questo test cellulare. È fondamentale eseguire un pipettaggio preciso per evitare il più possibile variazioni di pipettaggio. Inoltre, altri fattori che potrebbero influenzare i risultati sperimentali, come il numero di cellule e lo stock virale utilizzato, devono essere mantenuti costanti tra le ripetizioni dell'esperimento. Questi sono fattori che influenzano fortemente la cinetica della crescita cellulare e dell'infezione e potrebbero quindi portare a variazioni nei valori calcolati di CIT50 e/o altri parametri.
Quando si esegue il test CEI in presenza di (potenziali) composti antivirali, è importante determinare se influenzano l'impedenza delle cellule in assenza di virus. La tecnica è così sensibile che le variazioni di impedenza potrebbero essere misurate ben al di sotto delle concentrazioni citotossiche del composto19.
Sebbene in questo articolo siano mostrati solo i dati ZIKV, il test può essere facilmente applicato ad altri virus citopatogeni (flavi), con uno sforzo di ottimizzazione minimo, come la determinazione ottimale della frequenza di monitoraggio CEI. Gli adattamenti del saggio CEI sono stati impiegati con vari virus umani e animali, come la chikungunya, l'influenza A e gli herpesvirus umani ed equini25,26,27,28. Qui, viene anche utilizzato come metodo semplice per la quantificazione dei titoli virali o per l'identificazione di composti antivirali. Questi studi hanno utilizzato l'analisi cellulare in tempo reale, un metodo CEI alternativo.
L'uso della tecnologia CEI è limitato ai tipi di cellule aderenti, poiché il principio del test si basa sulle proprietà delle cellule aderenti per diffondersi attraverso i pozzetti incorporati nell'elettrodo. I rivestimenti superficiali del pozzo come la fibronectina possono essere utilizzati per migliorare l'attaccamento cellulare29. La metodologia presenta altri inconvenienti, il primo legato al suo costo. Oltre all'investimento nel dispositivo di monitoraggio CEI e nell'hardware e nel software di accompagnamento, anche i materiali di consumo sono piuttosto costosi. Inoltre, poiché il protocollo richiede il monitoraggio dell'infezione virale per diversi giorni, è possibile valutare una piastra da 96 pozzetti a settimana. Insieme al costo elevato, questo limita l'utilizzo a impostazioni di velocità effettiva medio-bassa.
A causa di questi problemi di throughput, la tecnologia non è adatta per le impostazioni di screening antivirale. Tuttavia, è molto interessante nelle fasi sperimentali iniziali, ad esempio, quando si valuta la suscettibilità cellulare per lo studio dell'infezione da ZIKV in un determinato contesto correlato alla malattia. La tecnologia è utile anche con linee cellulari trasfettate o knockout per osservare facilmente i cambiamenti nella cinetica dell'infezione, ad esempio, in presenza o assenza di determinati recettori di ingresso. Questo è interessante quando si studia il coinvolgimento di fattori cellulari nell'infezione da ZIKV. Inoltre, nelle fasi precliniche successive, quando è stato selezionato un determinato candidato principale, il test CEI può essere utilizzato per un'ulteriore caratterizzazione approfondita di un composto selezionato. I biosensori CEI possono anche essere modificati immobilizzando alcuni elementi di bioriconoscimento, come gli anticorpi virus-specifici, per la rilevazione di virus18. Nel complesso, ciò evidenzia l'uso versatile dell'Ince in un contesto virologico.
Disclosures
Gli autori confermano che non vi è alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Clément Heymann e Gorrit Lootsma per la correzione del manoscritto. Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni interne del Laboratorio di virologia e chemioterapia (Rega Institute, KU Leuven).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-185 | These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate. |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Live/dead stain |
| Cellstar polypropylene tubes, 15 mL | Greiner bio-one | 1,88,271 | |
| Cellstar polypropylene tubes, 50 mL | Greiner bio-one | 2,27,261 | |
| Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 41965-039 | Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| ECIS cultureware 96W20idf | Applied BioPhysics | 96W20idf PET | Assay plate for CEI device |
| Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station | Applied BioPhysics | CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device | |
| Falcon polystyrene tubes, 5 mL | Corning | 352054 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SV30160.03 | Cell culture medium additive for all used cells |
| HEL 299 cells | ATCC | CCL-137 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| HEPES buffer, 1 M | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | Cell culture medium additive for U87 cells |
| Labyrinthopeptin A1 | Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany | Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO. | |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Luna cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | |
| Luna-FL dual fluoresence cell counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell viability counter |
| Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 19993013 | Cell culture medium for A549 cells |
| Sodium Bicarbonate, 7.5% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25080-060 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Tissue culture flask T75 | TPP | Y9076 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | Dissociation reagent |
| U87 cells | ATCC | HTB-14 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| Virkon Rely+On tablets | Lanxess | 115-0020 | Disinfectant sollution |
| Zika virus (ZIKV) MR766 | ATCC | VR-84 | ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968 |
| ZIKV PRVABC59 | ATCC | VR-1843 | ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015 |
References
- Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
- Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
- Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
- Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725 (2018).
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792 (2011).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309 (2018).
- Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039 (2017).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
- Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922 (2022).
- Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122 (2022).
- Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471 (2020).
- Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
- Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
- Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503 (2020).
- Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137 (2012).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133 (2021).
- Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
- Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
- Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126 (2022).
