Valutazione della risposta immunitaria di un vaccino adiuvante nanoemulsione contro l'infezione da Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA)
Summary
Il presente protocollo prepara e valuta le proprietà fisiche, la risposta immunitaria e l’effetto protettivo in vivo di un nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione.
Abstract
I vaccini adiuvanti a nanoemulsione hanno attirato molta attenzione a causa delle loro piccole dimensioni delle particelle, dell’elevata stabilità termica e della capacità di indurre risposte immunitarie valide. Tuttavia, stabilire una serie di protocolli completi per valutare la risposta immunitaria di un nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione è vitale. Pertanto, questo articolo presenta una procedura rigorosa per determinare le caratteristiche fisico-chimiche di un vaccino (mediante microscopia elettronica a trasmissione [TEM], microscopia a forza atomica [AFM] e diffusione dinamica della luce [DLS]), la stabilità dell’antigene e del sistema del vaccino (mediante un test di centrifuga ad alta velocità, un test di stabilità termodinamica, SDS-PAGE e western blot) e la risposta immunitaria specifica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono valutare accuratamente l’effetto protettivo di un nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione in un modello murino di MRSA252 letale. Con questi protocolli, è possibile identificare l’adiuvante del vaccino nanoemulsione più promettente in termini di potenziale adiuvante efficace. Inoltre, i metodi possono aiutare a ottimizzare nuovi vaccini per lo sviluppo futuro.
Introduction
Lo Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA) è un patogeno opportunista con uno dei più alti tassi di infezione in un’unità di terapia intensiva (ICU) reparti1, reparti di cardiologia e reparti ustionati in tutto il mondo. L’MRSA presenta alti tassi di infezione, mortalità e ampia resistenza ai farmaci, presentando grandi difficoltà nel trattamento clinico2. Nell’elenco delle priorità globali dei batteri resistenti agli antibiotici pubblicato dall’Organizzazione mondiale della sanità (OMS) nel 2017, l’MRSA è stato elencatonella categoria 3 più critica. È quindi urgentemente necessario un vaccino contro l’infezione da MRSA.
L’adiuvante di alluminio è stato utilizzato per lungo tempo e il meccanismo ausiliario adiuvante è relativamente chiaro, sicuro, efficace e ben tollerato4. Gli adiuvanti di alluminio sono attualmente un tipo di coadiuvante ampiamente utilizzato. Si ritiene generalmente che gli antigeni adsorbiti su particelle di sale di alluminio possano migliorare la stabilità e migliorare la capacità del sito di iniezione di assorbire gli antigeni, fornendo un buon assorbimento e un lento rilascio5. Attualmente, il principale svantaggio degli adiuvanti di alluminio è che mancano di un effetto adiuvante o mostrano solo un debole effetto adiuvante su alcuni antigeni candidati al vaccino6. Inoltre, gli adiuvanti di alluminio inducono reazioni di ipersensibilità IgE-mediate5. Pertanto, è necessario sviluppare nuovi adiuvanti per stimolare una risposta immunitaria più forte.
Gli adiuvanti di nanoemulsione sono sistemi di dispersione colloidale composti da olio, acqua, tensioattivi e cotensioattivi7. Inoltre, gli adiuvanti sono termodinamicamente stabili e isotropi, possono essere autoclavati o stabilizzati mediante centrifugazione ad alta velocità e possono formarsi spontaneamente in condizioni di preparazione blande. Diversi adiuvanti di emulsione (come la serie MF59, NB001-002, la serie AS01-04, ecc.) sono attualmente sul mercato o in fase di ricerca clinica, ma le loro dimensioni delle particelle sono superiori a 160 nm8. Pertanto, i vantaggi dei preparati medicinali su scala nanometrica (1-100 nm) (vale a dire, grande superficie specifica, piccola dimensione delle particelle, effetto superficiale, alta energia superficiale, effetto di piccole dimensioni ed effetto di tunneling quantistico macro) non possono essere pienamente sfruttati. Nel presente protocollo, è stato riportato che un nuovo adiuvante basato sulla tecnologia della nanoemulsione con una dimensione del diametro di 1-100 nm mostra una buona attività adiuvante9. Abbiamo testato la proteina di fusione del frammento attivo della subunità del vaccino di ricombinazione HI (mutante α-emolisina [Hla] e proteina di fusione attiva del frammento attivo della subunità N2 del fattore B della superficie dello ione Fe [IsdB]); Sono state stabilite una serie di procedure per esaminare le proprietà fisiche e la stabilità, valutare la sua risposta anticorpale specifica dopo somministrazione intramuscolare e testare l’effetto protettivo del vaccino utilizzando un modello di infezione sistemica murina.
Protocol
Representative Results
Discussion
IsdB, una proteina di superficie ancorata alla parete cellulare batterica e regolata dal ferro, svolge un ruolo importante nel processo di ottenimento del ferro eme15. Hla, tossina alfa, è tra le tossine batteriche più efficaci conosciute nell’MRSA e può formare pori nelle cellule eucariotiche e interferire con l’adesione e le cellule epiteliali16. Nel nostro studio, una nuova proteina antigene MRSA di ricombinazione (HI) è stata costruita ed espressa …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata dal n. 2021YFC2302603 del National Key Research and Development Program of China, No. 32070924 e 32000651 del NSFC e No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Natural Science Foundation Project Program di Chongqing.
Materials
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
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