Evaluering af immunresponset af en nanoemulsionsadjuvansvaccine mod methicillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) infektion
Summary
Denne protokol forbereder og evaluerer de fysiske egenskaber, immunrespons og in vivo beskyttende virkning af en ny nanoemulsionsadjuvansvaccine.
Abstract
Nanoemulsionsadjuvansvacciner har tiltrukket sig stor opmærksomhed på grund af deres lille partikelstørrelse, høj termisk stabilitet og evne til at fremkalde gyldigt immunrespons. Imidlertid er etablering af en række omfattende protokoller til evaluering af immunresponset af en ny nanoemulsionsadjuvansvaccine afgørende. Derfor indeholder denne artikel en streng procedure til bestemmelse af en vaccines fysisk-kemiske egenskaber (ved transmissionselektronmikroskopi [TEM], atomkraftmikroskopi [AFM] og dynamisk lysspredning [DLS]), stabiliteten af vaccineantigenet og systemet (ved en højhastighedscentrifugetest, en termodynamisk stabilitetstest, SDS-PAGE og western blot) og det specifikke immunrespons (IgG1, IgG2a og IgG2b). Ved hjælp af denne tilgang kan forskere nøjagtigt evaluere den beskyttende virkning af en ny nanoemulsionsadjuvansvaccine i en dødelig MRSA252 musemodel. Med disse protokoller kan den mest lovende nanoemulsionsvaccineadjuvans med hensyn til effektivt adjuvanspotentiale identificeres. Derudover kan metoderne hjælpe med at optimere nye vacciner til fremtidig udvikling.
Introduction
Methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) er et opportunistisk patogen med en af de højeste infektionsrater på en intensivafdeling (ICU) afdeling1, kardiologiske afdelinger og brandsårsafdelinger over hele verden. MRSA udviser høje infektionsrater, dødelighed og bred lægemiddelresistens, hvilket giver store vanskeligheder ved klinisk behandling2. På den globale prioritetsliste over antibiotikaresistente bakterier, der blev frigivet af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) i 2017, blev MRSA opført i den mest kritiske kategori3. Der er derfor et presserende behov for en vaccine mod MRSA-infektion.
Aluminiumadjuvans er blevet brugt i lang tid, og adjuvanshjælpemekanismen er relativt klar, sikker, effektiv og godt tolereret4. Aluminium adjuvanser er i øjeblikket en meget anvendt type adjuvans. Det antages generelt, at antigener adsorberet på aluminiumsaltpartikler kan forbedre stabiliteten og forbedre injektionsstedets evne til at optage antigener, hvilket giver god absorption og langsom frigivelse5. I øjeblikket er den største ulempe ved aluminiumadjuvanser, at de mangler en adjuvansvirkning eller kun udviser en svag adjuvansvirkning på nogle vaccinekandidatantigener6. Derudover inducerer aluminiumadjuvanser IgE-medierede overfølsomhedsreaktioner5. Derfor er det nødvendigt at udvikle nye adjuvanser for at stimulere et stærkere immunrespons.
Nanoemulsionsadjuvanser er kolloide dispersionssystemer sammensat af olie, vand, overfladeaktive stoffer og cosuraktive stoffer7. Derudover er adjuvanserne termodynamisk stabile og isotrope, kan autoklaveres eller stabiliseres ved højhastighedscentrifugering og kan dannes spontant under milde præparationsbetingelser. Flere emulsionsadjuvanser (såsom MF59, NB001-002-serien, AS01-04-serien osv.) er i øjeblikket på markedet eller i klinisk forskningsfase, men deres partikelstørrelser er større end 160 nm8. Derfor kan fordelene ved lægemidler i nanoskala (1-100 nm) (dvs. stort specifikt overfladeareal, lille partikelstørrelse, overfladeeffekt, høj overfladeenergi, lille størrelseseffekt og makrokvantetunneleffekt) ikke udnyttes fuldt ud. I denne protokol er det rapporteret, at en ny adjuvans baseret på nanoemulsionsteknologi med en diameterstørrelse på 1-100 nm udviser god adjuvansaktivitet9. Vi testede rekombinationsunderenheden vaccine antigenprotein HI (α-hæmolysinmutant [Hla] og Fe ion overflade bestemmelse faktor B [IsdB] underenhed N2 aktivt fragmentfusionsprotein); En række procedurer blev etableret for at undersøge de fysiske egenskaber og stabilitet, evaluere dets specifikke antistofrespons efter intramuskulær administration og teste vaccinens beskyttende virkning ved hjælp af en musesystemisk infektionsmodel.
Protocol
Representative Results
Discussion
IsdB, et bakterielt cellevægforankret og jernreguleret overfladeprotein, spiller en vigtig rolle i processen med at opnå hæmjern15. Hla, alfa-toksin, er blandt de mest effektive bakterielle toksiner, der er kendt i MRSA, og kan danne porer i eukaryote celler og forstyrre vedhæftning og epitelceller16. I vores undersøgelse blev et nyt rekombinations-MRSA-antigenprotein (HI) konstrueret og udtrykt med genteknologiteknologi baseret på antigengenerne fra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af nr. 2021YFC2302603 fra National Key Research and Development Program of China, nr. 32070924 og 32000651 fra NSFC og nr. 2019jcyjA-msxmx0159 fra Natural Science Foundation Project Program of Chongqing.
Materials
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
Riferimenti
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O’Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. . Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
- Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Biologia Molecolare. 53 (5), 799-814 (2019).
