Isolement, culture et caractérisation des fibroblastes cutanés primaires à partir de tissus chéloïdes humains
Summary
Cette étude décrit un protocole optimisé pour établir des fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes capables de fournir efficacement et régulièrement des fibroblastes purs et viables.
Abstract
Les fibroblastes, le principal type cellulaire dans le tissu chéloïde, jouent un rôle essentiel dans la formation et le développement des chéloïdes. L’isolement et la culture de fibroblastes primaires dérivés de tissus chéloïdes sont à la base d’études plus approfondies de la fonction biologique et des mécanismes moléculaires des chéloïdes, ainsi que de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les traiter. La méthode traditionnelle d’obtention de fibroblastes primaires présente des limites, telles qu’un mauvais état cellulaire, le mélange avec d’autres types de cellules et la susceptibilité à la contamination. Cet article décrit un protocole optimisé et facilement reproductible qui pourrait réduire l’apparition de problèmes possibles lors de l’obtention de fibroblastes. Dans ce protocole, les fibroblastes peuvent être observés 5 jours après l’isolement et atteignent près de 80% de confluence après 10 jours de culture. Ensuite, les fibroblastes sont passés et vérifiés à l’aide d’anticorps PDGFRα et vimentine pour les tests d’immunofluorescence et d’anticorps CD90 pour la cytométrie en flux. En conclusion, les fibroblastes du tissu chéloïde peuvent être facilement acquis grâce à ce protocole, ce qui peut fournir une source abondante et stable de cellules dans le laboratoire pour la recherche chéloïde.
Introduction
Chéloïde, une maladie fibroproliférative, se manifeste par la croissance continue de plaques qui envahissent souvent la peau normale environnante sans autolimitation et provoquent divers degrés de démangeaisons, de douleurs et de fardeaux cosmétiques et psychologiques pour les patients1. Les fibroblastes, les cellules primaires impliquées dans les chéloïdes, jouent un rôle essentiel dans la formation et le développement de cette maladie par une prolifération excessive, une production redondante de matrice extracellulaire et des collagènes désorganisés 2,3. Cependant, la pathogenèse sous-jacente reste floue et il manque encore une méthode thérapeutique efficace pour la chéloïde; Par conséquent, il est urgent de poursuivre les recherches 4,5.
Comme il n’existe pas de modèle animal idéal pour la recherche chéloïde in vivo 6,7, la construction d’un modèle in vitro par l’acquisition de fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes peut offrir faisabilité et fiabilité pour la recherche chéloïde 2,6. Les cellules primaires sont celles qui proviennent directement de tissus vivants, et il est généralement reconnu que ces cellules peuvent ressembler davantage à l’état physiologique et au bagage génétique de plusieurs individus que les lignées cellulaires 8,9. La culture de cellules primaires fournit un moyen puissant d’étudier la croissance et le métabolisme des cellules, ainsi que d’autres phénotypes cellulaires.
À l’heure actuelle, il existe deux méthodes d’acquisition de fibroblastes primaires: la digestion enzymatique et la culture d’explant. Cependant, plusieurs obstacles ont été identifiés à l’obtention de fibroblastes primaires, tels que le risque de contamination par diverses bactéries ou champignons, le mélange avec d’autres types de cellules qui ne sont pas facilement éliminées, la longue période du cycle de culture, les modifications ultérieures des caractéristiques cellulaires par rapport aux cellules d’origine, etc.9. Par conséquent, le développement d’un processus réalisable et efficace pour obtenir des fibroblastes primaires est la base d’études et d’applications ultérieures. Cette étude décrit un protocole optimisé pour extraire les fibroblastes primaires des tissus chéloïdes qui peuvent fournir efficacement et régulièrement des fibroblastes purs et viables.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’obtention de fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes est une base essentielle pour la poursuite des recherches. Jusqu’à présent, il existait deux méthodes d’acquisition de fibroblastes primaires: la digestion enzymatique et la culture d’explant11,12,13,14. Cependant, les deux méthodes traditionnelles ont des limites, telles que la susceptibilité à la contamination…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 81903189 et 82073418) et de la Fondation pour la science et la technologie de Guangzhou (numéro de subvention 202102020025).
Materials
| 1.5 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| 15 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% polyformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | Cell fixation |
| 50 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8081 | Put keloid tissue |
| Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG | Abcam | Alexa Fluor 555 | second antibody for immunofluorescence staining assay |
| Anti human CD90 | BioLegend | B301002 | Identify the purity of fibroblasts |
| Antibody diluent | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 series A2 | Isolation and culture cells |
| Bovine serum albumin | aladdin | B265993 | Blocking for immunofluorescence staining assay |
| Carbon dioxide incubator | ESCO | CCL-170B-8 | Using for culturing cells |
| Cell cryotubes | Corning | 43513 | Store the cells in low temperature |
| centrifugal machine | Thermo Fisher | ST 16R | Discard supernatant |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | Stain the cellular nucleus |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Using for preserving cells |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | C11995500BT | Culture medium solution |
| Fetal bovine serum | BI | 04-001-1A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCelesta | Observing the identity of cells |
| frozen box | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Laser confocal microscope | Nikon | AIR-HD25 | Observing the immunofluorescence staining assay |
| PDGFR-α antibody | CST | 3174T | First antibody for immunofluorescence staining assay |
| Penicillin-streptomycin-Am solution | Solarbio | P1410 | Add in culture medium solution to avoid contamination |
| petri dish | JETBIOFIL | 7556 | Culture fibroblasts |
| Phosphate buffered saline solution | Gibco | C10010500BT | Culture medium solution |
| Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE) | Cell Signaling Technology | 5742S | As a control for flow cytometry |
| Round coverslip | Biosharp | 801007 | Cell culture |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Punch holes in the cell membrane |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Used for passaging cells |
| Vimentin antibody | Abcam | ab8978 | First antibody for immunofluorescence staining assay |
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