Живая визуализация приема пыльцевой трубки Arabidopsis и двойного оплодотворения с использованием метода полу-in vitro cum septum
Summary
Здесь мы описываем усовершенствование метода полу-in vitro (SIV) для наблюдения за наведением и приемом пыльцевой трубки у Arabidopsis thaliana, что повышает восприимчивость яйцеклеток. Высокопроизводительный метод SIV cum septum может быть связан с маркерными линиями гаметофитов и генетически кодируемыми биосенсорами для мониторинга динамического процесса оплодотворения.
Abstract
У цветковых растений рост и направление пыльцевой трубки (мужского гаметофита) внутри пестика и прием пыльцевой трубки женским гаметофитом необходимы для двойного оплодотворения и последующего развития семян. Взаимодействие между мужскими и женскими гаметофитами во время приема пыльцевой трубки завершается разрывом пыльцевой трубки и высвобождением двух сперматозоидов для осуществления двойного оплодотворения. Поскольку рост пыльцевой трубки и двойное оплодотворение глубоко скрыты в тканях цветка, этот процесс трудно наблюдать in vivo.
Метод полу-in vitro (SIV) для визуализации оплодотворения в живых клетках модельного растения Arabidopsis thaliana был разработан и внедрен в нескольких исследованиях. Эти исследования помогли выяснить фундаментальные особенности того, как происходит процесс оплодотворения у цветковых растений и какие клеточные и молекулярные изменения происходят при взаимодействии мужских и женских гаметофитов. Однако, поскольку эти эксперименты по визуализации живых клеток включают удаление отдельных яйцеклеток, они ограничены небольшим количеством наблюдений за сеанс визуализации, что делает этот подход утомительным и очень трудоемким. Среди других технических трудностей часто сообщается о неспособности пыльцевых трубок оплодотворить яйцеклетки in vitro , что серьезно затрудняет такие анализы.
Здесь представлен подробный видеопротокол для визуализации приема и оплодотворения пыльцевой трубки автоматизированным и высокопроизводительным способом, что позволяет проводить до 40 наблюдений за приемом и разрывом пыльцевой трубки за сеанс визуализации. В сочетании с использованием генетически кодируемых биосенсоров и маркерных линий этот метод позволяет генерировать большие размеры выборки с меньшими затратами времени. Нюансы и критические моменты метода, включая постановку цветка, вскрытие, подготовку среды и визуализацию, четко детализированы в видеоформате, чтобы облегчить будущие исследования динамики наведения, приема и двойного оплодотворения пыльцевой трубки.
Introduction
Рождение генетически уникального потомства у организмов, размножающихся половым путем, зависит от успешного слияния мужских и женских гамет. У цветковых растений взаимодействие двух мужских гамет (сперматозоидов) с двумя женскими гаметами (яйцеклеткой и центральной клеткой) при двойном оплодотворении зависит от высвобождения сперматозоидов из пыльцевой трубки (мужского гаметофита). Этот процесс, называемый рецепцией пыльцевой трубки, в значительной степени контролируется синергидными клетками, которые находятся в зародышевом мешке (женский гаметофит)1,2. Поскольку прием пыльцевой трубки происходит глубоко внутри цветка, был создан метод, позволяющий визуализировать процесс в живых клетках, называемый приемом пыльцевой трубки полуin vitro (SIV)3. С помощью этого метода иссеченные семяпочки Arabidopsis помещают на полужидкую среду для прорастания пыльцы и нацелены на пыльцевые трубки, которые прорастают через рыльце и стиль пестика, разорванного на стыке 3,4, передающего стиль. С момента разработки этого метода подробные наблюдения привели к нескольким открытиям, связанным с руководством, приемом и оплодотворением пыльцевых трубок. Среди прочего, эти открытия включают приобретение способности нацеливания на пыльцевые трубки путем роста через стигму3, начало внутриклеточных колебаний кальция в синергидах при поступлении пыльцевой трубки 5,6,7,8,9 и динамику высвобождения и оплодотворения сперматозоидов при разрыве пыльцевой трубки10 . Тем не менее, поскольку этот метод основан на иссечении яйцеклеток, количество наблюдений за оплодотворением ограничено, а прием пыльцевой трубки часто является аберрантным, что приводит к отказу от разрыва пыльцевой трубки (видео 1 и дополнительный файл 1). Поэтому существует потребность в более эффективном подходе, позволяющем проводить высокопроизводительный анализ приема и оплодотворения пыльцевых трубок.
При разработке этого протокола было протестировано несколько новых подходов к анализу приема пыльцевой трубки, охватывающих от самых «пробирочных» до самых «естественных методов», и была разработана эффективная методика, основанная на иссечении всей перегородки, которая позволяет проводить до 40 наблюдений за оплодотворением в день. Здесь описываются нюансы и критические моменты техники, включая постановку цветов, вскрытие, подготовку среды и настройки изображения. Следуя этому протоколу, следует облегчить исследования, посвященные наведению пыльцевой трубки, приему пыльцевой трубки и двойному оплодотворению. Ожидается, что более высокие размеры выборки, допускаемые методом, поддержат научную обоснованность выводов, сделанных из экспериментов с визуализацией в реальном времени. Потенциальные применения этого метода включают, но не ограничиваются этим, выполнение наблюдений за молекулярными и физиологическими изменениями цитозольных концентраций кальция ([Ca2+] цит), рН или H 2 O2 вовремя взаимодействия гаметофитов с использованием генетически кодируемых биосенсоров. Кроме того, цитологические изменения, такие как дегенерация рецептивного синергида, миграция сперматозоидов или кариогамия, можно легче наблюдать с помощью этого улучшенного метода. Наконец, сроки различных стадий оплодотворения можно контролировать с помощью широкопольной микроскопии, а затем можно провести более подробный анализ с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) или двухфотонной микроскопии возбуждения (2PEM) для более высокого разрешения и 3D-реконструкции.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи представлен эффективный протокол визуализации приема пыльцевой трубки и двойного оплодотворения у арабидопсиса. Усовершенствованный метод, SIV cum septum, значительно увеличивает процент и общее количество успешных событий приема пыльцевой трубки, которые наблюд…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Сару Симонини и Стефано Бенсивенгу за пожертвование конструкции pFG:roGFP2-ORP1-NLS , а также Кристофа Эйхенбергера, Иоганна Альмендингера, Винсента Саттера и Селию Бару за их советы по микроскопии. Мы благодарим за советы Рави Паланивелу, Филиппа Деннингера, Шэрон Кесслер, Марка Джонсона, Томокадзу Кавасимы и всех остальных участников Международной конференции по репродукции половых растений 2022 года, которые проявили интерес к протоколу SIV cum septum. Эта работа была поддержана Цюрихским университетом и грантами Швейцарского национального научного фонда для У.Г.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
Riferimenti
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7 (2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645 (2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722 (2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
