Levande avbildning av Arabidopsis pollenrörsmottagning och dubbelbefruktning med semi-in vitro cum septum-metoden
Summary
Här beskriver vi en förbättring av semi-in vitro (SIV) metoden för observation av pollenrörsstyrning och mottagning i Arabidopsis thaliana, vilket ökar mottagligheten av ägglossor. SIV cum septum-metoden med hög genomströmning kan kopplas till gametofytmarkörlinjer och genetiskt kodade biosensorer för att övervaka den dynamiska befruktningsprocessen.
Abstract
I blommande växter är tillväxten och styrningen av pollenröret (manlig gametofyt) inom pistilen och mottagandet av pollenröret av den kvinnliga gametofyten avgörande för dubbel befruktning och efterföljande fröutveckling. Samspelet mellan manliga och kvinnliga gametofyter under pollenrörsmottagning kulminerar i pollenrörsbrott och frisättning av två spermier för att åstadkomma dubbel befruktning. Eftersom pollenrörstillväxt och dubbel befruktning är djupt dolda i blommans vävnader är denna process svår att observera in vivo.
En semi-in vitro (SIV) metod för levande cellavbildning av befruktning i modellväxten Arabidopsis thaliana har utvecklats och implementerats i flera undersökningar. Dessa studier har bidragit till att belysa de grundläggande dragen i hur befruktningsprocessen sker i blommande växter och vilka cellulära och molekylära förändringar som uppstår under interaktionen mellan manliga och kvinnliga gametofyter. Men eftersom dessa levande cellavbildningsexperiment involverar excision av enskilda ägglossor, är de begränsade till ett lågt antal observationer per bildsession, vilket gör detta tillvägagångssätt tråkigt och mycket tidskrävande. Bland andra tekniska svårigheter rapporteras ofta att pollenrören inte kan befrukta ägglossningarna in vitro , vilket allvarligt förvirrar sådana analyser.
Här tillhandahålls ett detaljerat videoprotokoll för avbildning av pollenrörsmottagning och befruktning på ett automatiserat och högt genomströmningssätt, vilket möjliggör upp till 40 observationer av pollenrörsmottagning och bristning per bildsession. Tillsammans med användningen av genetiskt kodade biosensorer och markörlinjer möjliggör denna metod generering av stora provstorlekar med en minskad tidsinvestering. Nyanser och kritiska punkter i tekniken, inklusive blomstaging, dissektion, mediumberedning och avbildning, beskrivs tydligt i videoformat för att underlätta framtida forskning om dynamiken i pollenrörsstyrning, mottagning och dubbelbefruktning.
Introduction
Genereringen av genetiskt unika avkommor i sexuellt reproducerande organismer är beroende av en framgångsrik fusion av manliga och kvinnliga könsceller. I blommande växter beror interaktionen mellan två manliga gameter (spermier) med två kvinnliga gameter (äggcell och central cell) under dubbelbefruktning på spermiefrisättning från pollenröret (den manliga gametofyten). Denna process, som kallas pollenrörsmottagning, styrs till stor del av de synergidceller som finns i embryosäcken (den kvinnliga gametofyten)1,2. Eftersom pollenrörsmottagning sker djupt inne i blomman har en metod som möjliggör levande cellavbildning av processen, kallad semi-in vitro (SIV) pollenrörsmottagning, etablerats3. Med denna metod placeras utskurna Arabidopsis-ägglossor på halvflytande pollengroningsmedium och riktas mot pollenrör som växer genom stigma och stil av en pistill avskuren vid den stilöverförande kanalkorsningen 3,4. Sedan utvecklingen av denna teknik har detaljerade observationer lett till flera upptäckter kring pollenrörsstyrning, mottagning och befruktning. Bland annat inkluderar dessa upptäckter förvärv av pollenrörsinriktningskompetens genom tillväxt genom stigma3, uppkomsten av intracellulära kalciumoscillationer i synergiderna vid pollenrörets ankomst 5,6,7,8,9 och dynamiken i spermiefrisättning och befruktning vid pollenrörsbrott 10 . Ändå, eftersom denna teknik bygger på excision av ägglossor, är observationerna av befruktning begränsade i antal, och pollenrörets mottagning är ofta avvikande, vilket resulterar i misslyckande av pollenrörsbrott (Video 1 och kompletterande fil 1). Därför finns det ett behov av ett effektivare tillvägagångssätt som möjliggör analyser med hög genomströmning av pollenrörsmottagning och befruktning.
Vid utvecklingen av detta protokoll testades flera nya metoder för att analysera pollenrörsmottagning, som sträcker sig från de mest “in vitro” till de mest “in vivo” -metoderna, och en effektiv teknik baserad på excision av hela septum bestämdes, vilket möjliggör upp till 40 observationer av befruktning per dag. Här beskrivs nyanserna och kritiska punkter i tekniken, inklusive blomstaging, dissektion, mediumberedning och bildinställningar. Genom att följa detta protokoll bör forskning med fokus på pollenrörsvägledning, pollenrörsmottagning och dubbel befruktning underlättas. De högre provstorlekar som metoden möjliggör förväntas stärka den vetenskapliga sundheten i slutsatserna från levande bildexperiment. De potentiella tillämpningarna av denna teknik inkluderar, men är inte begränsade till, att utföra observationer av molekylära och fysiologiska förändringar i cytosoliska kalciumkoncentrationer ([Ca2 +] cyt), pH ellerH2O2under gametofytinteraktioner genom användning av genetiskt kodade biosensorer. Dessutom kan cytologiska förändringar, såsom degeneration av den receptiva synergiden, spermiecellsmigration eller karyogami, lättare observeras med denna förbättrade metod. Slutligen kan tidpunkten för de olika stadierna av befruktning övervakas under widefieldmikroskopi, och sedan kan mer detaljerade analyser med konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) eller tvåfotonexcitationsmikroskopi (2PEM) utföras för högre upplösning och 3D-rekonstruktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta manuskript introducerar ett effektivt protokoll för avbildning av pollenrörsmottagning och dubbelbefruktning i Arabidopsis. Den förbättrade metoden, SIV cum septum, ökar kraftigt andelen och det totala antalet framgångsrika pollenrörsmottagningshändelser som kan observeras per bildsession. De representativa resultaten som visas här visar en bildbehandling med 41 framgångsrika pollenrörsmottagningshändelser och 10 ägglossor som visar mottagningsdefekter (~ 80% effektivitet). Detta är …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Sara Simonini och Stefano Bencivenga för att ha donerat pFG:roGFP2-ORP1-NLS-konstruktionen och Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter och Celia Baroux för deras råd om mikroskopi. Vi tackar Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima och alla andra på International Conference on Sexual Plant Reproduction 2022 som visade intresse för ett protokoll om SIV cum septum. Detta arbete stöddes av universitetet i Zürich och bidrag från Swiss National Science Foundation till U.G.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
Riferimenti
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7 (2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645 (2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722 (2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
