Un flujo de trabajo para la optimización de la formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) utilizando experimentos de proceso de mezcla diseñados y modelos de conjunto autovalidados (SVEM)

Summary

Este protocolo proporciona un enfoque para la optimización de la formulación sobre los factores de estudio de mezcla, continuos y categóricos que minimiza las opciones subjetivas en la construcción del diseño experimental. Para la fase de análisis, se emplea un procedimiento de ajuste de modelado efectivo y fácil de usar.

Abstract

Presentamos un enfoque de estilo Quality by Design (QbD) para optimizar las formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP), con el objetivo de ofrecer a los científicos un flujo de trabajo accesible. La restricción inherente en estos estudios, donde las proporciones molares de lípidos ionizables, auxiliares y PEG deben sumar hasta el 100%, requiere métodos especializados de diseño y análisis para acomodar esta restricción de mezcla. Centrándonos en los factores lipídicos y de proceso que se utilizan comúnmente en la optimización del diseño de LNP, proporcionamos pasos que evitan muchas de las dificultades que tradicionalmente surgen en el diseño y análisis de experimentos de procesos de mezcla mediante el empleo de diseños de llenado de espacio y la utilización del marco estadístico recientemente desarrollado de modelos de conjunto autovalidados (SVEM). Además de producir formulaciones óptimas candidatas, el flujo de trabajo también crea resúmenes gráficos de los modelos estadísticos ajustados que simplifican la interpretación de los resultados. Las formulaciones candidatas recientemente identificadas se evalúan con ejecuciones de confirmación y, opcionalmente, se pueden realizar en el contexto de un estudio de segunda fase más completo.

Introduction

Las formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP) para sistemas de administración de genes in vivo generalmente involucran cuatro lípidos constituyentes de las categorías de lípidos ionizables, ayudantes y PEG ^1,2,3. Ya sea que estos lípidos se estén estudiando solos o simultáneamente con otros factores que no son de mezcla, los experimentos para estas formulaciones requieren diseños de “mezcla” porque, dada una formulación candidata, aumentar o disminuir la proporción de cualquiera de los lípidos conduce necesariamente a una disminución o aumento correspondiente en la suma de las proporciones de los otros tres lípidos.

A modo de ejemplo, se supone que estamos optimizando una formulación de LNP que actualmente utiliza una receta establecida que se tratará como punto de referencia. El objetivo es maximizar la potencia del LNP y, secundariamente, minimizar el tamaño promedio de partícula. Los factores de estudio que varían en el experimento son las proporciones molares de los cuatro lípidos constituyentes (ionizable, colesterol, DOPE, PEG), la relación N: P, la tasa de flujo y el tipo de lípido ionizable. Los lípidos ionizables y auxiliares (incluido el colesterol) pueden variar en un rango más amplio de relación molar, 10-60%, que PEG, que variará de 1-5% en esta ilustración. La receta de formulación de referencia y los rangos de los otros factores y su granularidad de redondeo se especifican en el Archivo complementario 1. Para este ejemplo, los científicos pueden realizar 23 corridas (lotes únicos de partículas) en un solo día y les gustaría usarlo como su tamaño de muestra si cumple con los requisitos mínimos. Los resultados simulados para este experimento se proporcionan en el Archivo Suplementario 2 y el Archivo Suplementario 3.

Rampado y Peer⁴ han publicado un artículo de revisión reciente sobre el tema de los experimentos diseñados para la optimización de los sistemas de administración de fármacos basados en nanopartículas. Kauffman et ^al.5 consideraron estudios de optimización de la PNL utilizando diseños factoriales fraccionales y de cribado definitivo⁶; Sin embargo, estos tipos de diseños no pueden acomodar una restricción de mezcla sin recurrir al uso de “variables de holgura” ineficientes7 y no se utilizan típicamente cuando los factores de mezcla están presentes ^7,8. En cambio, los “diseños óptimos” capaces de incorporar una restricción de mezcla se utilizan tradicionalmente para experimentos de proceso de mezcla⁹. Estos diseños se dirigen a una función especificada por el usuario de los factores de estudio y solo son óptimos (en uno de varios sentidos posibles) si esta función captura la verdadera relación entre los factores de estudio y las respuestas. Obsérvese que en el texto hay una distinción entre “diseños óptimos” y “candidatos a formulación óptima”, y este último se refiere a las mejores formulaciones identificadas por un modelo estadístico. Los diseños óptimos vienen con tres desventajas principales para los experimentos de proceso de mezcla. Primero, si el científico no anticipa una interacción de los factores del estudio al especificar el modelo objetivo, entonces el modelo resultante estará sesgado y puede producir formulaciones candidatas inferiores. En segundo lugar, los diseños óptimos colocan la mayoría de las ejecuciones en el límite exterior del espacio factorial. En los estudios de LNP, esto puede conducir a un gran número de corridas perdidas si las partículas no se forman correctamente en ningún extremo de los lípidos o configuraciones de proceso. En tercer lugar, los científicos a menudo prefieren tener ejecuciones experimentales en el interior del espacio factorial para obtener un sentido independiente del modelo de la superficie de respuesta y observar el proceso directamente en regiones previamente inexploradas del espacio factorial.

Un principio de diseño alternativo es apuntar a una cobertura uniforme aproximada del espacio factorial (restringido por mezcla) con un diseño que llene el espacio¹⁰. Estos diseños sacrifican cierta eficiencia experimental en relación con los diseños óptimos⁹ (suponiendo que todo el espacio factorial conduce a formulaciones válidas) pero presentan varios beneficios en una compensación que son útiles en esta aplicación. El diseño de relleno de espacio no hace ninguna suposición a priori sobre la estructura de la superficie de respuesta; Esto le da la flexibilidad para capturar relaciones imprevistas entre los factores de estudio. Esto también agiliza la generación de diseño porque no requiere tomar decisiones sobre qué términos de regresión agregar o quitar a medida que se ajusta el tamaño de ejecución deseado. Cuando algunos puntos de diseño (recetas) conducen a formulaciones fallidas, los diseños que llenan el espacio permiten modelar el límite de falla sobre los factores de estudio al tiempo que respaldan modelos estadísticos para las respuestas del estudio sobre las combinaciones de factores exitosas. Finalmente, la cobertura interior del espacio factorial permite la exploración gráfica independiente del modelo de la superficie de respuesta.

Para visualizar el subespacio del factor de mezcla de un experimento de proceso de mezcla, se utilizan “gráficas ternarias” triangulares especializadas. La figura 1 motiva este uso: en el cubo de puntos donde se permite que tres ingredientes oscilen entre 0 y 1, los puntos que satisfacen una restricción de que la suma de los ingredientes es igual a 1 se resaltan en rojo. La restricción de mezcla en los tres ingredientes reduce el espacio factorial factible a un triángulo. En aplicaciones de LNP con cuatro ingredientes de mezcla, producimos seis gráficos ternarios diferentes para representar el espacio factorial trazando dos lípidos a la vez contra un eje “Otros” que representa la suma de los otros lípidos.

Figura 1: Regiones de factor triangular. En la gráfica de relleno de espacio dentro del cubo, los pequeños puntos grises representan formulaciones que son inconsistentes con la restricción de mezcla. Los puntos rojos más grandes se encuentran en un triángulo inscrito dentro del cubo y representan formulaciones para las cuales se satisface la restricción de mezcla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Además de los factores de mezcla de lípidos, a menudo hay uno o más factores de proceso continuos, como la relación N: P, la concentración de tampón o la velocidad de flujo. Los factores categóricos pueden estar presentes, como el tipo de lípido ionizable, el tipo de lípido ayudante o el tipo de tampón. El objetivo es encontrar una formulación (una mezcla de lípidos y ajustes para factores de proceso) que maximice alguna medida de potencia y / o mejore las características fisicoquímicas, como minimizar el tamaño de partícula y PDI (índice de polidispersidad), maximizar la encapsulación porcentual y minimizar los efectos secundarios, como la pérdida de peso corporal, en estudios in vivo . Incluso cuando se parte de una receta de referencia razonable, puede haber interés en volver a optimizar dado un cambio en la carga útil genética o al considerar cambios en los factores de proceso o tipos de lípidos.

Cornell⁷ proporciona un texto definitivo sobre los aspectos estadísticos de los experimentos de mezcla y proceso de mezcla, con Myers et ^al.9 proporcionando un excelente resumen de los temas de diseño y análisis de mezclas más relevantes para la optimización. Sin embargo, estos trabajos pueden sobrecargar a los científicos con detalles estadísticos y con terminología especializada. El software moderno para el diseño y análisis de experimentos proporciona una solución robusta que soportará suficientemente la mayoría de los problemas de optimización de LNP sin tener que apelar a la teoría relevante. Si bien los estudios más complicados o de alta prioridad aún se beneficiarán de la colaboración con un estadístico y pueden emplear diseños óptimos en lugar de llenar el espacio, nuestro objetivo es mejorar el nivel de comodidad de los científicos y fomentar la optimización de las formulaciones de LNP sin apelar a pruebas ineficientes de un factor a la vez (OFAT)¹¹ o simplemente conformarse con la primera formulación que satisfaga las especificaciones.

En este artículo, se presenta un flujo de trabajo que utiliza software estadístico para optimizar un problema genérico de formulación de LNP, abordando problemas de diseño y análisis en el orden en que se encontrarán. De hecho, el método funcionará para problemas generales de optimización y no se limita a los LNP. En el camino, se abordan varias preguntas comunes que surgen y se proporcionan recomendaciones que se basan en la experiencia y en los resultados de la simulación¹². El marco recientemente desarrollado de modelos de conjunto autovalidados (SVEM)¹³ ha mejorado enormemente el enfoque frágil para analizar los resultados de los experimentos de procesos de mezcla, y utilizamos este enfoque para proporcionar una estrategia simplificada para la optimización de la formulación. Si bien el flujo de trabajo se construye de una manera general que podría seguirse utilizando otros paquetes de software, JMP 17 Pro es único en ofrecer SVEM junto con las herramientas de resumen gráfico que hemos encontrado necesarias para simplificar el análisis arcano de los experimentos de procesos de mezcla. Como resultado, también se proporcionan instrucciones específicas de JMP en el protocolo.

SVEM emplea la misma base del modelo de regresión lineal que el enfoque tradicional, pero nos permite evitar modificaciones tediosas que se requieren para ajustarse a un “modelo completo” de efectos candidatos mediante el uso de un enfoque base de selección directa o selección penalizada (Lazo). Además, SVEM proporciona un ajuste mejorado de “modelo reducido” que minimiza el potencial de incorporación de ruido (proceso más varianza analítica) que aparece en los datos. Funciona promediando los modelos predichos resultantes de reponderar repetidamente la importancia relativa de cada ejecución en el modelo 13,14,15,16,17,18. SVEM proporciona un marco para modelar experimentos de mezcla-proceso que es más fácil de implementar que la regresión tradicional de un solo disparo y produce candidatos de formulación óptima de mejor calidad^12,13. Los detalles matemáticos de SVEM están más allá del alcance de este documento e incluso un resumen superficial más allá de la revisión de la literatura relevante distraería de su principal ventaja en esta aplicación: permite un procedimiento de hacer clic para ejecutar simple, robusto y preciso para los profesionales.

El flujo de trabajo presentado es consistente con el enfoque de Calidad por Diseño (QbD)¹⁹ para el desarrollo farmacéutico²⁰. El resultado del estudio será una comprensión de la relación funcional que vincula los atributos materiales y los parámetros del proceso con los atributos críticos de calidad (CQAs⁾²¹. Daniel et ^al.22 discuten el uso de un marco QbD específicamente para la producción de plataformas de ARN: nuestro flujo de trabajo podría usarse como una herramienta dentro de este marco.

Protocol

El experimento descrito en la sección Resultados Representativos se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y los procedimientos se realizaron siguiendo las pautas establecidas por nuestro Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Se obtuvieron comercialmente ratones hembra Balb/C de 6-8 semanas de edad. Los animales recibieron comida y agua estándar ad libitum y fueron alojados en condiciones estándar con ciclos de luz / oscuridad de 12 horas, …

Representative Results

Este enfoque ha sido validado en ambos tipos de lípidos ampliamente clasificados: lípidos clásicos similares a MC3 y lipidoides (por ejemplo, C12-200), generalmente derivados de la química combinatoria. En comparación con una formulación de referencia de LNP desarrollada utilizando un método de un factor a la vez (OFAT), las formulaciones candidatas generadas a través de nuestro flujo de trabajo con frecuencia demuestran mejoras de potencia de 4 a 5 veces en una escala logarítmica, como se muestra en las lectura…

Discussion

El software moderno para el diseño y análisis de experimentos de procesos de mezcla hace posible que los científicos mejoren sus formulaciones de nanopartículas lipídicas en un flujo de trabajo estructurado que evita la experimentación OFAT ineficiente. El enfoque de modelado SVEM recientemente desarrollado elimina muchas de las modificaciones de regresión arcanas y las estrategias de reducción del modelo que pueden haber distraído previamente a los científicos con consideraciones estadísticas extrañas. Una v…

Materials

JMP Pro 17.1

JMP Statistical Discovery LLC