使用 体外 锌转运测定表征哺乳动物锌转运蛋白

Summary

由于与蛋白质功能的因果关系较弱且时间分辨率低，锌转运已被证明具有挑战性。该协议描述了一种通过使用Zn 2 +敏感荧光染料以高时间分辨率监测活细胞中Zn 2 +挤出的方法，从而提供Zn^{2 +}外排的直接测量。

Abstract

过渡金属（如Zn²⁺离子）由于其细胞毒性而必须受到严格调控。以前，通过测定不同浓度Zn²+下转运蛋白的表达水平来间接测量Zn²⁺转运蛋白的活性。这是通过利用免疫组化、测量组织中的 mRNA 或确定细胞 Zn²⁺ 水平来完成的。随着细胞内Zn 2+传感器的发展，锌转运蛋白的活性目前主要通过关联使用荧光探针检测的细胞内Zn 2+的变化与Zn²⁺转运蛋白的表达来确定。然而，即使在今天，也只有少数实验室监测细胞内Zn²⁺的动态变化，并用它来直接测量锌转运蛋白的活性。部分问题在于，在ZnT家族的10种锌转运蛋白中，除了ZnT10（转运锰）外，只有锌转运蛋白1（ZnT1）位于质膜上。因此，将转运活性与细胞内Zn²⁺浓度的变化联系起来是很困难的。本文介绍了一种使用基于锌特异性荧光染料 FluoZin-3 的测定法确定锌传输动力学的直接方法。这种染料以酯的形式加载到哺乳动物细胞中，然后由于细胞二酯酶活性而被困在胞质溶胶中。细胞利用锌²⁺ 离子载体吡硫酮加载锌 2⁺。ZnT1活性从细胞洗脱后荧光减少的线性部分评估。在 470 nm 激发和 520 nm 发射下测量的荧光与游离细胞内 Zn²⁺ 成正比。选择用mCherry荧光基团标记的表达ZnT1的细胞可以仅监测表达转运蛋白的细胞。该测定用于研究 ZnT1 蛋白的不同结构域对人 ZnT1 转运机制的贡献，ZnT1 是一种从细胞中挤出过量锌的真核跨膜蛋白。

Introduction

锌是细胞环境中必需的微量元素。它包含所有蛋白质的三分之一，并参与各种细胞过程，例如催化¹、转录² 和结构基序³。然而，尽管是氧化还原惰性的，但高浓度的锌对细胞有毒，这就是为什么没有哺乳动物生物体在没有调节锌稳态的机制的情况下生存的原因。在哺乳动物中，有三种机制负责这一过程：（1）金属硫蛋白，它是富含胞质半胱氨酸的蛋白质，以高亲和力结合锌，从而防止过量的游离胞质锌⁴;（2） Zrt/Irrt 样蛋白 （ZIP），它们是锌转运蛋白，负责锌通过质膜或细胞内细胞器流入胞质溶胶 4,5,6,7,8;（3） ZnTs，是无处不在的阳离子扩散促进剂 （CDF） 家族的哺乳动物亚群，是锌转运蛋白，因为它们将锌从胞质溶胶挤出穿过质膜或进入细胞内细胞器4,5,6,7,8,9。由于锌对细胞代谢的重要性，了解细胞锌动力学至关重要。

以前评估锌动力学的方法依赖于通过将mRNA与固定组织或细胞的细胞锌测量值相关联来评估不同锌条件下mRNA的表达水平^10,11,12。这些方法包括化学检测和免疫组化染色。然而，这些方法只能产生间接测量，因此只能确定细胞内锌浓度与锌转运蛋白表达之间的离线相关性。因此，这些方法无法推断任何需要高时间分辨率的参数。

锌²⁺ 输运的更直接测量使用锌¹³的放射性同位素。该方法依赖于放射性标记Zn²⁺ 的测量来监测锌的传输及其动力学。然而，由于锌对细胞稳态的重要性，多个细胞过程调节细胞内锌浓度。其中包括细胞外结合和几种协同工作以维持细胞内 Zn²⁺ 水平的严格控制的运输系统。这些过程的结合会产生相当大的背景噪声，这使得测试单个与锌相关的传递函数变得困难。

本文展示了一种通过使用锌特异性荧光染料 FluoZin-3 测量细胞内游离锌浓度来直接监测锌转运速率的方法。该染料对Zn²⁺ 具有高度特异性，并且几乎不受其他二价阳离子（如钙）的干扰。此外，以酯的形式，它通过非离子扩散进入细胞，然后由于细胞内二酯酶的活性而被捕获。因此，其荧光主要与游离胞质锌浓度相关。这些实验旨在研究锌转运蛋白1（ZnT1）的结构-功能关系，ZnT1是ZnT家族的成员。

Protocol

1. 细胞转染 在补充有10%胎牛血清（FBS），2mM L-谷氨酰胺和1x青霉素/链霉素（参见 材料表）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞在37°C / 5%CO2 的湿润培养箱中培养，直到汇合在10cm平板上（8.8×106 个细胞）。 将一个 13 mm 盖玻片放入 12 孔板的每个孔中。在 12 mL 完全 DMEM 中稀释步骤 1.1 中的 0.44 x10 6 个胰蛋白酶消化细胞。通?…

Representative Results

ZnT1 是一种哺乳动物锌转运蛋白，位于细胞质膜上13。它是阳离子扩散促进剂 （CDF） 蛋白家族的成员，可将锌从胞质溶胶挤出到细胞外毫14。ZnT1 具有双结构域结构：跨膜结构域（跨膜结构域）和 C 端结构域14。与其他已知的 CDF 蛋白不同，ZnT1 具有扩展的非结构化 C 末端结构域 （USCTD）。USCTD的作用目前尚不清楚。我们使用上述方案将ZnT1 WT与没…

Discussion

上述方法允许以高时间分辨率直接测量细胞内锌浓度。与其他方法相比，这种涉及监测细胞内Zn²⁺变化的方法可以显着降低背景噪声。此外，染料对锌的选择性消除了与其他金属阳离子的潜在交叉相互作用^18,19。最后，它没有直接的细胞毒性，可以测试活细胞过程¹⁹。

但是，这种方法有一定的局限性。首先?…

Materials

10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665