由于与蛋白质功能的因果关系较弱且时间分辨率低,锌转运已被证明具有挑战性。该协议描述了一种通过使用Zn 2 +敏感荧光染料以高时间分辨率监测活细胞中Zn 2 +挤出的方法,从而提供Zn2 +外排的直接测量。
过渡金属(如Zn2+离子)由于其细胞毒性而必须受到严格调控。以前,通过测定不同浓度Zn2+下转运蛋白的表达水平来间接测量Zn2+转运蛋白的活性。这是通过利用免疫组化、测量组织中的 mRNA 或确定细胞 Zn2+ 水平来完成的。随着细胞内Zn 2+传感器的发展,锌转运蛋白的活性目前主要通过关联使用荧光探针检测的细胞内Zn 2+的变化与Zn2+转运蛋白的表达来确定。然而,即使在今天,也只有少数实验室监测细胞内Zn2+的动态变化,并用它来直接测量锌转运蛋白的活性。部分问题在于,在ZnT家族的10种锌转运蛋白中,除了ZnT10(转运锰)外,只有锌转运蛋白1(ZnT1)位于质膜上。因此,将转运活性与细胞内Zn2+浓度的变化联系起来是很困难的。本文介绍了一种使用基于锌特异性荧光染料 FluoZin-3 的测定法确定锌传输动力学的直接方法。这种染料以酯的形式加载到哺乳动物细胞中,然后由于细胞二酯酶活性而被困在胞质溶胶中。细胞利用锌2+ 离子载体吡硫酮加载锌 2+。ZnT1活性从细胞洗脱后荧光减少的线性部分评估。在 470 nm 激发和 520 nm 发射下测量的荧光与游离细胞内 Zn2+ 成正比。选择用mCherry荧光基团标记的表达ZnT1的细胞可以仅监测表达转运蛋白的细胞。该测定用于研究 ZnT1 蛋白的不同结构域对人 ZnT1 转运机制的贡献,ZnT1 是一种从细胞中挤出过量锌的真核跨膜蛋白。
锌是细胞环境中必需的微量元素。它包含所有蛋白质的三分之一,并参与各种细胞过程,例如催化1、转录2 和结构基序3。然而,尽管是氧化还原惰性的,但高浓度的锌对细胞有毒,这就是为什么没有哺乳动物生物体在没有调节锌稳态的机制的情况下生存的原因。在哺乳动物中,有三种机制负责这一过程:(1)金属硫蛋白,它是富含胞质半胱氨酸的蛋白质,以高亲和力结合锌,从而防止过量的游离胞质锌4;(2) Zrt/Irrt 样蛋白 (ZIP),它们是锌转运蛋白,负责锌通过质膜或细胞内细胞器流入胞质溶胶 4,5,6,7,8;(3) ZnTs,是无处不在的阳离子扩散促进剂 (CDF) 家族的哺乳动物亚群,是锌转运蛋白,因为它们将锌从胞质溶胶挤出穿过质膜或进入细胞内细胞器4,5,6,7,8,9。由于锌对细胞代谢的重要性,了解细胞锌动力学至关重要。
以前评估锌动力学的方法依赖于通过将mRNA与固定组织或细胞的细胞锌测量值相关联来评估不同锌条件下mRNA的表达水平10,11,12。这些方法包括化学检测和免疫组化染色。然而,这些方法只能产生间接测量,因此只能确定细胞内锌浓度与锌转运蛋白表达之间的离线相关性。因此,这些方法无法推断任何需要高时间分辨率的参数。
锌2+ 输运的更直接测量使用锌13的放射性同位素。该方法依赖于放射性标记Zn2+ 的测量来监测锌的传输及其动力学。然而,由于锌对细胞稳态的重要性,多个细胞过程调节细胞内锌浓度。其中包括细胞外结合和几种协同工作以维持细胞内 Zn2+ 水平的严格控制的运输系统。这些过程的结合会产生相当大的背景噪声,这使得测试单个与锌相关的传递函数变得困难。
本文展示了一种通过使用锌特异性荧光染料 FluoZin-3 测量细胞内游离锌浓度来直接监测锌转运速率的方法。该染料对Zn2+ 具有高度特异性,并且几乎不受其他二价阳离子(如钙)的干扰。此外,以酯的形式,它通过非离子扩散进入细胞,然后由于细胞内二酯酶的活性而被捕获。因此,其荧光主要与游离胞质锌浓度相关。这些实验旨在研究锌转运蛋白1(ZnT1)的结构-功能关系,ZnT1是ZnT家族的成员。
上述方法允许以高时间分辨率直接测量细胞内锌浓度。与其他方法相比,这种涉及监测细胞内Zn2+变化的方法可以显着降低背景噪声。此外,染料对锌的选择性消除了与其他金属阳离子的潜在交叉相互作用18,19。最后,它没有直接的细胞毒性,可以测试活细胞过程19。
但是,这种方法有一定的局限性。首先?…
The authors have nothing to disclose.
Raz Zarivach 得到了以色列科学基金会的支持(资助号:163/22)。Tomer Eli Ben Yosef 和 Arie Moran 得到了以色列科学基金会的支持(资助号:2047/20)。我们要感谢丹尼尔·吉特勒(Daniel Gitler)及其在本古里安大学(Ben-Gurion University)的团队的合作、支持和专业知识。
10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
Sigma Aldrich | 31665 |