توصيف ناقلات الزنك في الثدييات باستخدام مقايسة نقل الزنك في المختبر
Summary
ثبت أن نقل الزنك يمثل صعوبة في القياس بسبب ضعف الروابط السببية لوظيفة البروتين والدقة الزمنية المنخفضة. يصف هذا البروتوكول طريقة للمراقبة ، بدقة زمنية عالية ، قذف Zn 2+ من الخلايا الحية باستخدام صبغة فلورية حساسة ل Zn 2+ ، وبالتالي توفير قياس مباشر لتدفق Zn2+.
Abstract
يجب تنظيم المعادن الانتقالية مثل أيونات Zn2+ بإحكام بسبب سميتها الخلوية. في السابق ، تم قياس نشاط ناقلات Zn 2+ بشكل غير مباشر عن طريق تحديد مستوى تعبير الناقل تحت تركيزات مختلفة من Zn2+. تم ذلك عن طريق استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، أو قياس mRNA في الأنسجة ، أو تحديد مستويات Zn2+ الخلوية. مع تطور مستشعرات Zn 2+ داخل الخلايا ، يتم تحديد أنشطة ناقلات الزنك حاليا بشكل أساسي من خلال ربط التغييرات في Zn 2+ داخل الخلايا ، والتي تم اكتشافها باستخدام مجسات الفلورسنت ، مع التعبير عن ناقلات Zn2+. ومع ذلك ، حتى اليوم ، هناك عدد قليل فقط من المختبرات التي تراقب التغيرات الديناميكية في Zn2+ داخل الخلايا وتستخدمها لقياس نشاط ناقلات الزنك مباشرة. جزء من المشكلة هو أنه من بين 10 ناقلات الزنك من عائلة ZnT ، باستثناء ZnT10 (ينقل المنغنيز) ، يتم توطين ناقل الزنك 1 (ZnT1) فقط في غشاء البلازما. لذلك ، من الصعب ربط نشاط النقل بالتغيرات في تركيز Zn2+ داخل الخلايا. توضح هذه المقالة طريقة مباشرة لتحديد حركية نقل الزنك باستخدام مقايسة تعتمد على صبغة فلورية خاصة بالزنك ، FluoZin-3. يتم تحميل هذه الصبغة في خلايا الثدييات في شكل استر ثم يتم احتجازها في السيتوسول بسبب نشاط ثنائي الإستراز الخلوي. يتم تحميل الخلايا ب Zn 2+ باستخدام بيريثيون الأيونوفور Zn2+. يتم تقييم نشاط ZnT1 من الجزء الخطي من الانخفاض في التألق بعد غسل الخلية. يتناسب التألق المقاس عند إثارة 470 نانومتر وانبعاث 520 نانومتر مع Zn2+ الحر داخل الخلايا. يسمح اختيار الخلايا التي تعبر عن ZnT1 الموسومة بفلوروفور mCherry بمراقبة الخلايا التي تعبر عن الناقل فقط. يستخدم هذا الفحص للتحقيق في مساهمة المجالات المختلفة لبروتين ZnT1 في آلية نقل ZnT1 البشري ، وهو بروتين عبر غشاء حقيقي النواة يقذف الزنك الزائد من الخلية.
Introduction
الزنك هو عنصر تتبع أساسي في الوسط الخلوي. وهو يشتمل على ثلث جميع البروتينات ويشارك في عمليات خلوية مختلفة ، مثل الحفز1 والنسخ2 والزخارف الهيكلية3. ومع ذلك ، على الرغم من كونها خاملة الأكسدة والاختزال ، فإن تركيزات الزنك العالية سامة للخلية ، وهذا هو السبب في عدم بقاء أي كائن حي في الثدييات دون وجود آليات تنظم توازن الزنك. في الثدييات ، هناك ثلاث آليات مسؤولة عن هذه العملية: (1) ميتالوثيونين ، وهي بروتينات غنية بالسيستين الخلوي تربط الزنك بتقارب عال ، وبالتالي تمنع الزنك الخلوي الحرالزائد 4 ؛ (2) البروتينات الشبيهة ب Zrt / IRT (ZIPs) ، وهي ناقلات الزنك المسؤولة عن تدفق الزنك إلى السيتوسول من خلال غشاء البلازما أو من العضيات داخل الخلايا4،5،6،7،8 ؛ و (3) ZnTs ، وهي مجموعة فرعية من الثدييات من عائلة ميسر الانتشار الكاتيوني في كل مكان (CDF) وهي ناقلات الزنك ، لأنها تقذف الزنك من السيتوسول عبر غشاء البلازما أو إلى العضيات داخل الخلايا4،5،6،7،8،9. نظرا لأهمية الزنك في التمثيل الغذائي الخلوي ، من الضروري فهم ديناميكيات الزنك الخلوية.
اعتمدت الطرق السابقة لتقييم ديناميكيات الزنك على تقييم مستويات التعبير عن mRNA في ظل ظروف الزنك المختلفة من خلال ربطها بقياسات الزنك الخلوية للأنسجة أو الخلايا الثابتة10،11،12. وتشمل هذه الطرق الكشف الكيميائي وتلطيخ الكيمياء المناعية. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لا تسفر إلا عن مقاييس غير مباشرة ، وبالتالي ، تحدد فقط وجود علاقة غير متصلة بالإنترنت بين تركيز الزنك داخل الخلايا والتعبير عن ناقلات الزنك. وبالتالي ، لا يمكن لهذه الطرق استنتاج أي معلمات تتطلب دقة زمنية عالية.
يستخدم القياس المباشر لنقل Zn2+ النظائر المشعة للزنك13. تعتمد هذه الطريقة على قياس Zn2+ المشع لمراقبة انتقال الزنك وحركيته. ومع ذلك، نظرا لأهمية الزنك في الاتزان الخلوي، تنظم العمليات الخلوية المتعددة تركيز الزنك داخل الخلايا. من بينها الربط خارج الخلية والعديد من أنظمة النقل التي تعمل بشكل متضافر للحفاظ على رقابة صارمة على مستويات Zn2+ داخل الخلايا. يؤدي الجمع بين هذه العمليات إلى حدوث ضوضاء كبيرة في الخلفية ، مما يجعل من الصعب اختبار وظائف النقل الفردية المتعلقة بالزنك.
توضح هذه المقالة طريقة لمراقبة معدل نقل الزنك مباشرة عن طريق قياس تركيز الزنك الحر داخل الخلايا باستخدام صبغة فلورية خاصة بالزنك ، FluoZin-3. تتميز الصبغة بخصوصية عالية ل Zn2+ وتداخل قليل من الكاتيونات ثنائية التكافؤ الأخرى ، مثل الكالسيوم. بالإضافة إلى ذلك ، في شكل استر ، يدخل الخلايا عن طريق الانتشار غير الأيوني ثم يتم احتجازه بسبب نشاط ثنائي الإستراز داخل الخلايا. وبالتالي ، يرتبط مضانه في المقام الأول مع تركيز الزنك الخلوي الحر. أجريت هذه التجارب لدراسة العلاقة بين البنية والوظيفة لناقل الزنك 1 (ZnT1) ، وهو عضو في عائلة ZnT.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسمح الطريقة الموصوفة أعلاه بالقياس المباشر لتركيز الزنك داخل الخلايا بدقة زمنية عالية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، يمكن لهذه الطريقة التي تتضمن مراقبة التغييرات في Zn2+ داخل الخلايا أن تقلل بشكل كبير من ضوضاء الخلفية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن انتقائية الصبغة للزنك تقضي على التفاعلات ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
راز زاريفاخ مدعوم من صندوق العلوم الإسرائيلي (منحة رقم 163/22). يتم دعم تومر إيلي بن يوسف وآري موران من قبل مؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة رقم 2047/20). نود أن نشكر دانيال جيتلر ومجموعته في جامعة بن غوريون على تعاونهم ودعمهم وخبرتهم.
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
Riferimenti
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters – A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer’s disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer’s disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d., Findley, S. d. Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -. L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. Microsphere-based real-time calcium sensing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
