Karakterisering af pattedyrs zinktransportører ved hjælp af et in vitro zinktransportassay
Summary
Zinktransport har vist sig at være udfordrende at måle på grund af de svage årsagssammenhænge til proteinfunktionen og den lave tidsmæssige opløsning. Denne protokol beskriver en metode til overvågning med høj tidsmæssig opløsning af Zn 2+ ekstrudering fra levende celler ved anvendelse af et Zn 2+ følsomt fluorescerende farvestof, hvilket giver et direkte mål for Zn2+ efflux.
Abstract
Overgangsmetaller såsom Zn2+ ioner skal reguleres stramt på grund af deres cellulære toksicitet. Tidligere blev aktiviteten af Zn 2+ transportører målt indirekte ved at bestemme transportørens ekspressionsniveau under forskellige koncentrationer af Zn2+. Dette blev gjort ved at anvende immunhistokemi, måle mRNA i vævet eller bestemme de cellulære Zn2+ niveauer. Med udviklingen af intracellulære Zn 2+ sensorer bestemmes zinktransportørernes aktiviteter i øjeblikket primært ved at korrelere ændringer i intracellulære Zn 2+, detekteret ved hjælp af fluorescerende sonder, med ekspressionen af Zn2+ transportørerne. Men selv i dag overvåger kun få laboratorier dynamiske ændringer i intracellulær Zn2+ og bruger den til at måle aktiviteten af zinktransportører direkte. En del af problemet er, at ud af de 10 zinktransportører i ZnT-familien, bortset fra ZnT10 (transporterer mangan), er kun zinktransportør 1 (ZnT1) lokaliseret ved plasmamembranen. Derfor er det svært at forbinde transportaktiviteten med ændringer i den intracellulære Zn2+ koncentration. Denne artikel beskriver en direkte måde at bestemme zinktransportkinetikken ved hjælp af et assay baseret på et zinkspecifikt fluorescerende farvestof, FluoZin-3. Dette farvestof indlæses i pattedyrceller i sin esterform og fanges derefter i cytosolen på grund af cellulær di-esteraseaktivitet. Cellerne er fyldt med Zn 2+ ved at udnytte Zn2+ ionoforpyrithion. ZnT1-aktiviteten vurderes ud fra den lineære del af reduktionen i fluorescens efter celleudvaskningen. Fluorescensen målt ved en excitation på 470 nm og emission på 520 nm er proportional med den frie intracellulære Zn2+. Valg af celler, der udtrykker ZnT1 mærket med mCherry-fluoroforen, giver kun mulighed for overvågning af cellerne, der udtrykker transportøren. Dette assay bruges til at undersøge bidraget fra forskellige domæner af ZnT1-protein til transportmekanismen for humant ZnT1, et eukaryot transmembranprotein, der ekstruderer overskydende zink fra cellen.
Introduction
Zink er et vigtigt sporstof i cellemiljøet. Det inkorporerer en tredjedel af alle proteiner og er involveret i forskellige cellulære processer, såsom katalyse1, transkription2 og strukturelle motiver3. På trods af at de er redox-inerte, er høje zinkkoncentrationer imidlertid giftige for cellen, hvorfor ingen pattedyrsorganisme har overlevet uden tilstedeværelsen af mekanismer, der regulerer zinkhomeostase. Hos pattedyr er tre mekanismer ansvarlige for denne proces: (1) metallothioneiner, som er cytosoliske cysteinrige proteiner, der binder zink ved høj affinitet og dermed forhindrer overskydende frit cytosolisk zink4; (2) Zrt/Irt-lignende proteiner (ZIP’er), som er zinktransportører, der er ansvarlige for zinktilstrømning til cytosolen gennem plasmamembranen eller fra intracellulære organeller 4,5,6,7,8; og (3) ZnT’er, som er en pattedyrsdelmængde af den allestedsnærværende kationdiffusionsfacilitatorfamilie (CDF) og er zinktransportører, da de ekstruderer zink fra cytosolen over plasmamembranen eller ind i de intracellulære organeller 4,5,6,7,8,9. På grund af zinks betydning for cellulær metabolisme er det vigtigt at forstå cellulær zinkdynamik.
Tidligere metoder til vurdering af zinkdynamik var afhængige af at vurdere ekspressionsniveauerne af mRNA under forskellige zinkbetingelser ved at korrelere dem med cellulære zinkmålinger af faste væv eller celler10,11,12. Disse metoder omfatter kemisk detektion og immunohistokemisk farvning. Disse metoder giver imidlertid kun indirekte mål og bestemmer således kun en offline korrelation mellem intracellulær zinkkoncentration og ekspressionen af zinktransportører. Derfor kan disse metoder ikke udlede nogen parametre, der kræver høj tidsmæssig opløsning.
En mere direkte måling af Zn2+ transport bruger radioaktive isotoper af zink13. Denne metode er afhængig af måling af radioaktivt mærket Zn2+ for at overvåge zinktransport og dens kinetik. På grund af zinks betydning for cellulær homeostase regulerer flere cellulære processer imidlertid intracellulær zinkkoncentration. Blandt disse er ekstracellulær binding og flere transportsystemer, der arbejder sammen for at opretholde tæt kontrol af intracellulære Zn2+ niveauer. Kombinationen af disse processer skaber betydelig baggrundsstøj, hvilket gør det vanskeligt at teste individuelle zinkrelaterede transportfunktioner.
Denne artikel demonstrerer en metode til direkte overvågning af zinktransporthastigheden ved at måle den intracellulære frie zinkkoncentration ved hjælp af et zinkspecifikt fluorescerende farvestof, FluoZin-3. Farvestoffet har høj specificitet for Zn2+ og lidt interferens fra andre divalente kationer, såsom calcium. Derudover kommer den i sin esterform ind i cellerne ved ikke-ionisk diffusion og fanges derefter på grund af aktiviteten af intracellulær di-esterase. Således er dets fluorescens primært korreleret med den frie cytosoliske zinkkoncentration. Disse eksperimenter blev udført for at studere struktur-funktionsforholdet mellem zinktransportør 1 (ZnT1), et medlem af ZnT-familien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ovenfor beskrevne metode muliggør direkte måling af den intracellulære zinkkoncentration med høj tidsopløsning. Sammenlignet med andre metoder kan denne metode, der involverer overvågning af ændringer i intracellulær Zn2+, reducere baggrundsstøj betydeligt. Derudover eliminerer farvestoffets selektivitet for zink potentielle krydsinteraktioner med andre metalkationer18,19. Endelig muliggør dets mangel på øjeblikkelig cytotoksicitet test…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Raz Zarivach er støttet af Israel Science Foundation (bevilling nr. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef og Arie Moran er støttet af Israel Science Foundation (bevilling nr. 2047/20). Vi vil gerne takke Daniel Gitler og hans gruppe på Ben-Gurion University for deres samarbejde, støtte og ekspertise.
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
Riferimenti
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters – A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer’s disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer’s disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d., Findley, S. d. Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -. L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. Microsphere-based real-time calcium sensing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
