In Vitro Zinc Transport Assay를 사용한 포유류 아연 수송체 특성 분석
Summary
아연 수송은 단백질 기능에 대한 인과 관계가 약하고 시간적 분해능이 낮기 때문에 측정하기 어려운 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 Zn 2+ 민감한 형광 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 높은 시간 분해능으로 Zn 2+ 압출을 모니터링하여 Zn2+ 유출을 직접 측정하는 방법을 설명합니다.
Abstract
Zn2+ 이온과 같은 전이 금속은 세포 독성으로 인해 엄격하게 조절되어야 합니다. 이전에는, Zn2+ 수송체의 활성은Zn2+의 상이한 농도 하에서 수송체의 발현 수준을 결정함으로써 간접적으로 측정되었다. 이는 면역조직화학을 이용하거나, 조직 내 mRNA를 측정하거나, 세포 Zn2+ 수준을 측정하여 수행되었습니다. 세포 내 Zn 2+ 센서의 개발로 아연 수송체의 활성은 현재 형광 프로브를 사용하여 검출된 세포 내 Zn 2+의 변화와 Zn2+ 수송체의 발현을 연관시킴으로써 주로 결정됩니다. 그러나 오늘날에도 세포 내 Zn2+의 동적 변화를 모니터링하고 이를 사용하여 아연 수송체의 활성을 직접 측정하는 실험실은 소수에 불과합니다. 문제의 일부는 ZnT10(망간 수송)을 제외한 ZnT 계열의 10개 아연 수송체 중 아연 수송체 1(ZnT1)만 원형질막에 국한되어 있다는 것입니다. 따라서 수송 활성을 세포 내 Zn2+ 농도의 변화와 연결하는 것은 어렵습니다. 이 글에서는 아연 특이적 형광 염료인 FluoZin-3을 기반으로 하는 분석을 사용하여 아연 수송 역학을 측정하는 직접적인 방법을 설명합니다. 이 염료는 에스테르 형태로 포유류 세포에 로드된 다음 세포 디에스테라제 활성으로 인해 세포질에 갇히게 됩니다. 세포는 Zn 2+ ionophore pyrithione을 사용하여 Zn2+로 로드됩니다. ZnT1 활성은 세포 세척 후 형광 감소의 선형 부분에서 평가됩니다. 470nm의 여기와 520nm의 방출에서 측정된 형광은 유리 세포 내 Zn2+에 비례합니다. mCherry 형광단으로 태그된 ZnT1을 발현하는 세포를 선택하면 수송체를 발현하는 세포만 모니터링할 수 있습니다. 이 분석법은 세포에서 과잉 아연을 압출하는 진핵 세포막 관통 단백질인 인간 ZnT1의 수송 메커니즘에 대한 ZnT1 단백질의 다양한 영역의 기여도를 조사하는 데 사용됩니다.
Introduction
아연은 세포 환경에서 필수적인 미량 원소입니다. 그것은 모든 단백질의 1/3을 포함하며 촉매작용 1, 전사2 및 구조 모티프3와 같은 다양한 세포 과정에 관여합니다. 그러나 산화 환원 불활성임에도 불구하고 높은 아연 농도는 세포에 독성이 있기 때문에 아연 항상성을 조절하는 메커니즘이 없으면 포유류 유기체가 생존하지 못했습니다. 포유류에서는 세 가지 메커니즘이 이 과정을 담당합니다: (1) 높은 친화력으로 아연과 결합하여 과도한 유리 세포질 아연을 방지하는 세포질 시스테인이 풍부한 단백질인 메탈로티오닌4; (2) Zrt/Irt 유사 단백질(ZIP)은 원형질막 또는 세포 내 소기관을 통해 세포질로 아연 유입을 담당하는 아연 수송체입니다 4,5,6,7,8; (3) ZnT는 유비쿼터스 양이온 확산 촉진제(CDF) 계열의 포유류 하위 집합이며 세포질에서 원형질막을 가로질러 또는 세포 내 소기관으로 아연을 압출할 때 아연 수송체입니다(4,5,6,7,8,9). 세포 대사에 대한 아연의 중요성으로 인해 세포 아연의 역학을 이해하는 것이 중요합니다.
아연 역학을 평가하는 이전 방법은 고정 조직 또는 세포의 세포 아연 측정과 상관 관계를 맺어 다양한 아연 조건에서 mRNA의 발현 수준을 평가하는 데 의존했습니다10,11,12. 이러한 방법에는 화학적 검출 및 면역조직화학 염색이 포함됩니다. 그러나 이러한 방법은 간접적인 측정만 수행하므로 세포 내 아연 농도와 아연 수송체의 발현 사이의 오프라인 상관관계만 결정합니다. 따라서 이러한 방법은 높은 시간 분해능이 필요한 매개 변수를 유추할 수 없습니다.
Zn2+ 수송에 대한 보다 직접적인 측정은 아연13의 방사성 동위원소를 사용합니다. 이 방법은 아연 수송 및 그 반응 속도를 모니터링하기 위해 방사성 표지된 Zn2+ 의 측정에 의존합니다. 그러나 세포 항상성에 대한 아연의 중요성으로 인해 여러 세포 과정이 세포 내 아연 농도를 조절합니다. 이 중에는 세포 외 결합과 세포 내 Zn2+ 수준의 엄격한 제어를 유지하기 위해 함께 작동하는 여러 수송 시스템이 있습니다. 이러한 공정의 조합은 상당한 배경 소음을 발생시켜 개별 아연 관련 수송 기능을 테스트하기 어렵게 만듭니다.
이 기사에서는 아연 특이적 형광 염료인 FluoZin-3을 사용하여 세포 내 유리 아연 농도를 측정하여 아연 수송 속도를 직접 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 염료는 Zn2+ 에 대한 특이성이 높고 칼슘과 같은 다른 2가 양이온의 간섭이 거의 없습니다. 또한 에스테르 형태에서는 비이온성 확산에 의해 세포에 들어간 다음 세포 내 디에스테라아제의 활성으로 인해 갇히게 됩니다. 따라서 형광은 주로 유리 세포질 아연 농도와 관련이 있습니다. 이 실험은 ZnT 계열의 구성원인 아연 수송체 1(ZnT1)의 구조-기능 관계를 연구하기 위해 수행되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
상술한 방법은 높은 시간적 분해능으로 세포내 아연 농도를 직접 측정할 수 있게 한다. 다른 방법과 비교하여, 세포 내Zn2+의 변화를 모니터링하는 이 방법은 배경 소음을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 또한, 아연에 대한 염료의 선택성은 다른 금속 양이온과의 잠재적인 교차 상호작용을 제거한다(18,19). 마지막으로, 즉각적인 세포 독성이 없기 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Raz Zarivach는 이스라엘 과학 재단(보조금 번호 163/22)의 지원을 받습니다. 토머 엘리 벤 요세프(Tomer Eli Ben Yosef)와 아리 모란(Arie Moran)은 이스라엘 과학 재단(Israel Science Foundation, 보조금 번호 2047/20)의 지원을 받고 있습니다. 벤구리온 대학교의 Daniel Gitler와 그의 그룹의 협력, 지원 및 전문 지식에 감사드립니다.
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
Riferimenti
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