Karakterisering av zinktransportörer hos däggdjur med hjälp av en in vitro zinktransportanalys
Summary
Zinktransport har visat sig vara utmanande att mäta på grund av de svaga orsakssambanden till proteinets funktion och den låga tidsupplösningen. Detta protokoll beskriver en metod för övervakning, med hög tidsupplösning, Zn 2+ extrudering från levande celler genom att använda ett Zn 2+ känsligt fluorescerande färgämne, vilket ger ett direkt mått på Zn2+ utflöde.
Abstract
Övergångsmetaller som Zn2+-joner måste regleras noggrant på grund av deras cellulära toxicitet. Tidigare mättes aktiviteten hos Zn 2+-transportörer indirekt genom att bestämma transportörens uttrycksnivå under olika koncentrationer av Zn2+. Detta gjordes genom att använda immunhistokemi, mäta mRNA i vävnaden eller bestämma de cellulära Zn2+-nivåerna. Med utvecklingen av intracellulära Zn 2+-sensorer bestäms zinktransportörernas aktiviteter för närvarande främst genom att korrelera förändringar i intracellulära Zn 2+, detekterade med fluorescerande sonder, med uttrycket av Zn 2+-transportörerna. Men även idag är det bara ett fåtal laboratorier som övervakar dynamiska förändringar i intracellulärt Zn2+ och använder det för att mäta aktiviteten hos zinktransportörer direkt. En del av problemet är att av de 10 zinktransportörerna i ZnT-familjen, med undantag för ZnT10 (transporterar mangan), är endast zinktransportör 1 (ZnT1) lokaliserad vid plasmamembranet. Därför är det svårt att koppla transportaktiviteten till förändringar i den intracellulära Zn2+-koncentrationen. Den här artikeln beskriver ett direkt sätt att bestämma zinktransportkinetiken med hjälp av en analys baserad på ett zinkspecifikt fluorescerande färgämne, FluoZin-3. Detta färgämne laddas in i däggdjursceller i sin esterform och fångas sedan i cytosolen på grund av cellulär di-esterasaktivitet. Cellerna laddas med Zn 2+ genom att använda Zn2+ jonoforpyrition. ZnT1-aktiviteten bedöms från den linjära delen av minskningen av fluorescensen efter cellurlakningen. Fluorescensen uppmätt vid en excitation på 470 nm och emission på 520 nm är proportionell mot det fria intracellulära Zn2+. Genom att välja de celler som uttrycker ZnT1 märkta med mCherry-fluoroforen kan endast de celler som uttrycker transportören övervakas. Denna analys används för att undersöka bidraget från olika domäner av ZnT1-protein till transportmekanismen för humant ZnT1, ett eukaryot transmembranprotein som extruderar överskott av zink från cellen.
Introduction
Zink är ett viktigt spårämne i cellmiljön. Den innehåller en tredjedel av alla proteiner och är involverad i olika cellulära processer, såsom katalys1, transkription2 och strukturella motiv3. Men trots att de är redox-inerta är höga zinkkoncentrationer giftiga för cellen, vilket är anledningen till att ingen däggdjursorganism har överlevt utan närvaron av mekanismer som reglerar zinkhomeostas. Hos däggdjur är tre mekanismer ansvariga för denna process: (1) metallothioneiner, som är cytosoliska cysteinrika proteiner som binder zink vid hög affinitet, vilket förhindrar överskott av fritt cytosoliskt zink4; (2) Zrt/Irt-liknande proteiner (ZIP), som är zinktransportörer som ansvarar för zinkinflöde till cytosolen genom plasmamembranet eller från intracellulära organeller 4,5,6,7,8. och (3) ZnTs, som är en undergrupp av däggdjur i den allestädes närvarande katjondiffusionsfacilitatorfamiljen (CDF) och är zinktransportörer, eftersom de extruderar zink från cytosolen över plasmamembranet eller in i de intracellulära organellerna 4,5,6,7,8,9. På grund av zinkens betydelse för cellulär metabolism är det viktigt att förstå cellulär zinkdynamik.
Tidigare metoder för att bedöma zinkdynamik var beroende av att bedöma uttrycksnivåerna av mRNA under olika zinkförhållanden genom att korrelera dem med cellulära zinkmätningar av fasta vävnader eller celler10,11,12. Dessa metoder inkluderar kemisk detektion och immunhistokemisk färgning. Dessa metoder ger dock endast indirekta mått och bestämmer därmed endast en offline-korrelation mellan intracellulär zinkkoncentration och uttrycket av zinktransportörer. Följaktligen kan dessa metoder inte härleda några parametrar som kräver hög tidsupplösning.
En mer direkt mätning av Zn2+ -transport använder radioaktiva isotoper avzink-13. Denna metod bygger på mätning av radioaktivt märkt Zn2+ för att övervaka zinktransport och dess kinetik. Men på grund av zinkens betydelse för cellulär homeostas reglerar flera cellulära processer intracellulär zinkkoncentration. Bland dessa finns extracellulär bindning och flera transportsystem som arbetar tillsammans för att upprätthålla strikt kontroll av intracellulära Zn2+ -nivåer. Kombinationen av dessa processer skapar ett betydande bakgrundsbrus, vilket gör det svårt att testa enskilda zinkrelaterade transportfunktioner.
Den här artikeln demonstrerar en metod för att direkt övervaka zinktransporthastigheten genom att mäta den intracellulära fria zinkkoncentrationen med hjälp av ett zinkspecifikt fluorescerande färgämne, FluoZin-3. Färgämnet har hög specificitet för Zn2+ och liten störning från andra tvåvärda katjoner, såsom kalcium. Dessutom, i sin esterform, kommer den in i cellerna genom nonjonisk diffusion och fångas sedan på grund av aktiviteten hos intracellulärt di-esteras. Således är dess fluorescens främst korrelerad med den fria cytosoliska zinkkoncentrationen. Dessa experiment utfördes för att studera struktur-funktionsförhållandet hos zinktransportör 1 (ZnT1), en medlem av ZnT-familjen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ovan beskrivna metoden möjliggör direkt mätning av den intracellulära zinkkoncentrationen med hög tidsupplösning. Jämfört med andra metoder kan denna metod som involverar övervakning av förändringar i intracellulärt Zn2+ avsevärt minska bakgrundsbruset. Dessutom eliminerar färgämnets selektivitet för zink potentiella korsinteraktioner med andra metallkatjoner18,19. Slutligen möjliggör dess brist på omedelbar cytotoxicitet testnin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Raz Zarivach stöds av Israel Science Foundation (anslag nr 163/22). Tomer Eli Ben Yosef och Arie Moran stöds av Israel Science Foundation (anslag nr 2047/20). Vi vill tacka Daniel Gitler och hans grupp vid Ben-Gurion University för deras samarbete, stöd och expertis.
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
Riferimenti
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters – A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer’s disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer’s disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d., Findley, S. d. Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -. L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. Microsphere-based real-time calcium sensing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
