Summary
La lesione non invasiva del legamento crociato anteriore è un metodo affidabile e clinicamente rilevante per l'avvio dell'osteoartrite post-traumatica (PTOA) nei topi. Questo metodo di lesione consente anche la quantificazione in vivo dell'attività della proteasi nell'articolazione nei primi punti temporali post-lesione utilizzando sonde nel vicino infrarosso attivabili dalla proteasi e imaging di riflettanza della fluorescenza.
Abstract
Le lesioni articolari traumatiche come la rottura del legamento crociato anteriore (LCA) o le rotture del menisco portano comunemente all'osteoartrite post-traumatica (PTOA) entro 10-20 anni dalla lesione. La comprensione dei processi biologici precoci avviati dalle lesioni articolari (ad esempio, infiammazione, metalloproteinasi della matrice (MMP), catepsina proteasi, riassorbimento osseo) è fondamentale per comprendere l'eziologia della PTOA. Tuttavia, ci sono poche opzioni per la misurazione in vivo di questi processi biologici e le risposte biologiche precoci possono essere confuse se vengono utilizzate tecniche chirurgiche invasive o iniezioni per avviare l'OA. Nei nostri studi sulla PTOA, abbiamo utilizzato sonde attivabili della proteasi nel vicino infrarosso disponibili in commercio combinate con l'imaging a riflettanza di fluorescenza (FRI) per quantificare l'attività della proteasi in vivo a seguito di lesioni non invasive del LCA indotte dalla compressione nei topi. Questo metodo non invasivo di lesione del LCA ricapitola fedelmente le condizioni di lesione clinicamente rilevanti ed è completamente asettico poiché non comporta l'interruzione della pelle o della capsula articolare. La combinazione di questi metodi di lesione e di imaging ci consente di studiare il decorso temporale dell'attività della proteasi in più punti temporali a seguito di una lesione articolare traumatica.
Introduction
L'osteoartrite è un problema di salute pervasivo che colpisce milioni di persone negli Stati Uniti1. L'osteoartrite post-traumatica (PTOA) è un sottogruppo dell'OA che viene avviato da una lesione articolare come la rottura del legamento crociato anteriore (LCA), una lesione del menisco o una frattura intra-articolare2. La percentuale di pazienti con OA sintomatica che possono essere classificati come PTOA è di almeno il 12%3 e questa eziologia colpisce tipicamente una popolazione più giovane rispetto all'OA idiopatica4. I modelli murini di OA sono strumenti cruciali per studiare l'eziologia della malattia e i potenziali trattamenti per l'OA in una tempistica molto più breve (4-12 settimane nei modelli murini rispetto a 10-20 anni negli esseri umani). Tuttavia, i metodi per iniziare l'OA nei topi comportano comunemente tecniche chirurgiche invasive come latransezione 5,6 del LCA, la rimozione o la destabilizzazione del menisco mediale 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 o una combinazione dei due 17,18,19, che non riproducono condizioni di lesione clinicamente rilevanti. I modelli chirurgici esacerbano anche l'infiammazione dell'articolazione a causa della rottura della capsula articolare, che potrebbe accelerare la progressione dell'OA.
I modelli murini non invasivi di lesione del ginocchio offrono l'opportunità di studiare i cambiamenti biologici e biomeccanici nei primi punti temporali post-infortunio e possono produrre risultati clinicamente più rilevanti20. Il nostro laboratorio ha stabilito un modello di lesione non invasivo che utilizza un singolo sovraccarico di compressione tibiale applicato esternamente per indurre la rottura del legamento crociato anteriore (LCA) nei topi 21,22,23,24. Questo metodo di lesione non invasivo è in grado di produrre una lesione articolare asettica senza interrompere la pelle o la capsula articolare.
L'imaging a riflettanza di fluorescenza (FRI) è un metodo di imaging ottico che consiste nell'eccitare un bersaglio con luce infrarossa a una lunghezza d'onda specifica e quantificare la luce riflessa emessa a un'altra lunghezza d'onda. Le sonde specifiche per proteasi disponibili in commercio possono essere iniettate in modelli animali e la FRI può quindi essere utilizzata per quantificare l'attività della proteasi in siti specifici come l'articolazione del ginocchio. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per il rilevamento in vivo di attività biologiche come l'infiammazione. Le sonde utilizzate per questa applicazione vengono temprate in fluorescenza fino a quando non incontrano proteasi rilevanti. Queste proteasi romperanno quindi un sito di scissione enzimatica sulle sonde, dopodiché produrranno un segnale fluorescente nel vicino infrarosso. Queste sonde e questo metodo di imaging sono stati ampiamente convalidati e utilizzati negli studi sul cancro 25,26,27,28 e sull'aterosclerosi 29,30,31,32, e il nostro gruppo li ha utilizzati per studi sul sistema muscolo-scheletrico per misurare i marcatori di infiammazione e degradazione della matrice 23,24,33.
Insieme, la lesione articolare non invasiva combinata con le sonde attivabili FRI e proteasi in vivo fornisce una capacità unica di monitorare l'infiammazione e l'attività della proteasi a seguito di una lesione articolare traumatica. Questa analisi può essere eseguita già ore o addirittura minuti dopo la lesione e lo stesso animale può essere valutato più volte per studiare il decorso temporale dell'attività della proteasi nell'articolazione. È importante sottolineare che questo metodo di imaging potrebbe non essere fattibile se combinato con modelli chirurgici di OA, poiché la rottura della pelle e della capsula articolare provoca un segnale di fluorescenza che confonderebbe il segnale dall'interno dell'articolazione.
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Protocol
Tutte le procedure descritte sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della California Davis. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di 3 mesi.
1. Lesione non invasiva del legamento crociato anteriore
NOTA: La lesione del legamento crociato anteriore prodotta da un carico di compressione applicato esternamente è un metodo semplice e riproducibile che ricapitola fedelmente le condizioni di lesione del legamento crociato anteriore nell'uomo. Questo protocollo è scritto per uno strumento di telaio di carico disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali), ma potrebbe essere adattato per sistemi simili.
- Aprire il software compatibile con lo strumento del telaio di carico (vedere Tabella dei materiali) e selezionare un file di controllo esistente o crearne uno nuovo.
- Accendere l'attuatore.
- Nel menu di calibrazione, tarare la lettura della forza della cella di carico e impostare lo spostamento dell'attuatore su 0.
- Utilizzare l'isoflurano inalato all'1%-4% di ossigeno per anestetizzare i topi e assicurarsi che gli animali siano completamente anestetizzati pizzicando le dita dei piedi e/o la coda.
- Posizionare il mouse in posizione prona sulla piattaforma. Posizionare la gamba inferiore verticalmente tra due dispositivi di carico (Figura 1) (vedere la tabella dei materiali). Inserire il piede nell'apertura dell'apparecchio superiore e il ginocchio nella coppa dell'apparecchio inferiore.
- Regolare manualmente l'altezza dell'apparecchio inferiore per applicare un precarico di 1-2 N (monitorato in tempo reale sullo schermo del computer) e serrare la vite di fermo per mantenere la posizione. Il precarico è necessario per mantenere la gamba nella posizione corretta prima di applicare il carico di lesione.
- Applicare un singolo carico di compressione a una forza target (~12-15 N) o a uno spostamento target (~1,5-2,0 mm).
NOTA: L'applicazione del carico a una velocità di caricamento inferiore (~1 mm/s) fornirà un livello maggiore di monitoraggio e controllo in tempo reale, ma probabilmente comporterà un errore di avulsione dell'ACL. L'applicazione di una velocità di carico più rapida (~200 mm/s) avrà maggiori probabilità di produrre una lesione del LCA a metà sostanza22. Se si determina che si è verificata una frattura tibiale o un'altra lesione eccessiva, sopprimere l'animale utilizzando un metodo approvato dalla IACUC prima che l'animale si riprenda dall'anestesia.- Impostare la velocità di carico nel file di controllo del software e confermare utilizzando i dati di forza-spostamento.
NOTA: La frattura ossea durante il carico di compressione tibiale non è in genere un problema poiché la forza di frattura (~20 N) è considerevolmente superiore alla forza di lesione del LCA. Tuttavia, questo dovrebbe essere monitorato con la palpazione e l'imaging (cioè i raggi X) può essere utilizzato per confermare che non si sono verificate fratture tibiali.
- Impostare la velocità di carico nel file di controllo del software e confermare utilizzando i dati di forza-spostamento.
- La lesione è tipicamente indicata da un suono ("clic" o "scricchiolio") e da un rilascio di forza identificabile sui grafici forza-spostamento (Figura 1C). Se si utilizza una velocità di carico più lenta, interrompere il carico di compressione immediatamente dopo la lesione per evitare ulteriori carichi e possibili danni ad altri tessuti articolari.
NOTA: La lesione del legamento crociato anteriore si verifica in genere a 8-15 N a seconda della massa corporea34. È importante impostare una forza target maggiore della forza prevista per la lesione del legamento crociato anteriore. - Confermare la lesione del legamento crociato anteriore utilizzando un test del cassetto anteriore-posteriore35,36 o una valutazione comparabile dell'instabilità articolare.
- Somministrare una dose dipendente dal peso dell'animale (ad esempio, 0,05-0,1 mg/kg SC o IP di buprenorfina, vedere la tabella dei materiali) ai topi dopo l'infortunio, con la durata e la dose raccomandate e approvate dall'istituzione di origine IACUC.
NOTA: I FANS possono alterare la progressione della PTOA dopo la lesione, quindi non è raccomandato che i FANS vengano utilizzati per la gestione del dolore in questo modello di lesione, a meno che non si tratti di un obiettivo specifico dello studio.
2. Preparazione animale per l'imaging FRI
NOTA: Per l'imaging ottico, la pelliccia di animale (in particolare la pelliccia scura) è altamente efficace nel bloccare, assorbire e disperdere la luce, pertanto la pelliccia deve essere rimossa il più possibile dall'area intorno alle articolazioni del ginocchio prima dell'imaging. Una crema depilatoria è in genere più efficace per la rimozione del pelo rispetto alle tosatrici. I topi nudi o glabri non richiedono la rimozione del pelo. Tuttavia, la rimozione del pelo è necessaria per i ceppi di topi più comunemente usati (ad esempio, C57BL/6). Se possibile, nutrire i topi con cibo purificato a bassa fluorescenza prima dell'imaging. Il cibo standard per topi contiene clorofilla, che auto-fluoresce con una lunghezza d'onda di circa 700 nm e può influenzare la raccolta dei dati dal sistema FRI nel vicino infrarosso.
- Anestetizzare i topi con l'1%-4% di isoflurano inalato nell'ossigeno. Tieni i topi su un termoforo il più possibile e applica un unguento per gli occhi per prevenire l'irritazione degli occhi.
- Utilizzare un batuffolo di cotone per applicare la crema depilatoria (vedere Tabella dei materiali) sulla parte anteriore (cranica) delle zampe dei topi intorno all'articolazione del ginocchio.
- Lascia riposare la crema per ~ 1 minuto, quindi usa delle salviette per rimuovere la crema e il pelo dalla gamba. Ripetere l'operazione se necessario.
- Una volta che le articolazioni del ginocchio sono completamente esposte senza peli che coprono l'area, pulisci le gambe con salviettine imbevute di alcol per rimuovere eventuali residui di crema depilatoria.
NOTA: La crema depilatoria può essere utilizzata sugli stessi topi più volte durante uno studio, ma queste applicazioni devono essere distanziate di almeno una settimana per evitare inutili irritazioni della pelle.
3. Preparazione della soluzione della sonda
- Se necessario, diluire la sonda attivabile a fluorescenza secondo le istruzioni del produttore in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) 1x. Un flaconcino della sonda disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali) contiene in genere 20 nmol in 0,15 mL di PBS 1x. Per diluire la soluzione nel flaconcino, aggiungere 1,35 mL di 1x PBS per ottenere 20 nmol in 1,5 mL di 1x PBS.
NOTA: Dopo la diluizione, è possibile utilizzare un flaconcino per l'imaging di dieci topi quando si iniettano 0,15 mL per topo. - Agitare la soluzione con una velocità minima (~2000 giri/min) per 30 s per assicurarsi che la sonda sia disciolta nella soluzione, quindi centrifugare brevemente per assicurarsi che tutto il liquido sia fuori dal coperchio.
NOTA: La soluzione può essere conservata a 2-8 °C in un luogo protetto dalla luce per un massimo di 12 mesi.
4. Iniezione retroorbitale
NOTA: Fare riferimento a Yardeni et al. per i dettagli di questa procedura37.
- Utilizzare l'isoflurano inalato all'1%-4% nell'ossigeno per anestetizzare i topi e posizionare il topo su un fianco con il muso in un cono nasale.
- Utilizzare siringhe da insulina da ~29 G per l'iniezione della soluzione della sonda (preparata al punto 3).
- Tenere la siringa coperta prima dell'uso per evitare l'esposizione alla luce.
- Quando si somministra l'iniezione:
- Iniettare all'interno dell'occhio (caruncola lacrimale) e assicurarsi che lo smusso della siringa sia inclinato verso l'occhio. Per i destrimani, si consiglia di iniettare nell'occhio destro del topo con l'animale rivolto a destra.
- Con la mano che non inietta, tirare delicatamente indietro la pelle intorno all'occhio per stabilizzare la testa e far sporgere l'occhio.
- Inclinare la siringa parallelamente al corpo del mouse.
- Far avanzare delicatamente la siringa oltre l'occhio fino a quando non incontra una resistenza rigida; Non tentare di spingersi oltre questo punto.
- Iniettare lentamente la soluzione della sonda nel seno retroorbitale, quindi estrarre lentamente l'ago dall'orbita dell'occhio. Se con l'ago non esce alcuna soluzione, l'iniezione ha esito positivo.
- Applicare soluzione fisiologica o unguento per gli occhi sull'occhio iniettato.
NOTA: In base alla documentazione fornita con le sonde di imaging, il tempo di imaging ottimale è in genere compreso tra 1 e 2 giorni dopo l'iniezione della soluzione della sonda. Se possibile, si consiglia di eseguire uno screening temporale iniziale per determinare il tempo di imaging ottimale per ogni applicazione specifica. I topi metabolizzeranno la sonda iniettata entro circa 7 giorni, dopodiché sarà necessario iniettare una nuova dose di soluzione per sonda se si desiderano ulteriori punti temporali.
5. Imaging in riflettanza di fluorescenza
NOTA: Le procedure descritte in questa sezione sono specifiche per un sistema di imaging ottico disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali). Immagini simili possono essere eseguite con sistemi comparabili.
- Anestetizzare i topi con l'1%-4% di isoflurano inalato nell'ossigeno e posizionare l'animale supino nel sistema di imaging con il muso in un cono nasale.
- Posizionare il mouse con la parte inferiore delle gambe distese in modo che le ginocchia siano leggermente rivolte in aria (potrebbe essere necessario fissare i piedi con del nastro adesivo). È fondamentale che venga utilizzato un posizionamento coerente per tutti gli animali.
- Aprire il software compatibile (vedere la tabella dei materiali) sul computer del sistema di imaging; apparirà il "Pannello di controllo dell'acquisizione".
- Per riscaldare il sistema, fare clic su Inizializza e attendere che la spia della temperatura diventi verde.
- Fare clic su Imaging Wizard e assicurarsi che venga visualizzata la finestra "Imaging Wizard".
- Fare clic su Filter Pair (Coppia filtri) e assicurarsi che l'impostazione sia su "Epi-Illumination", quindi premere Next (Avanti).
- Per selezionare le impostazioni corrette di eccitazione/emissione, individuare la sonda di interesse dall'elenco a discesa. Se non si riesce a trovare la sonda corretta, trovare il nome 'Input Ex/Em' e digitare manualmente il valore di Excitation Peak e Emission Peak in base alla proprietà della sonda da utilizzare (ad esempio, per Excitation Peak, immettere 675 e per Emission Peak, immettere 720). Fare clic su Avanti.
- Scegliere Mouse per "Imaging Subject" (Soggetto imaging). In "Parametri di esposizione", assicurarsi che le impostazioni automatiche siano selezionate e che le opzioni Fluorescente e Fotografia siano selezionate. Selezionare D-22,6 cm nell'elenco di controllo di "Campo visivo". Premere Next (Avanti).
- L'impostazione dell'immagine può essere visualizzata e modificata sul pannello di destra del "Pannello di controllo dell'acquisizione". Assicurarsi che tutte le impostazioni siano corrette e premere il pulsante Acquisisci sequenza . Dopo che l'immagine viene visualizzata, verificare che l'immagine abbia un'esposizione adeguata. In caso contrario, modificare l'impostazione del tempo di esposizione e fare nuovamente clic su Acquisisci sequenza .
- Per analizzare l'immagine, posizionare un cerchio della regione di interesse (ROI) di dimensioni coerenti su ciascuna articolazione del ginocchio sull'immagine in bianco e nero (in questo modo si evita un posizionamento distorto basato su aree di segnale fluorescente).
- Calcolare l'efficienza radiante totale e/o l'efficienza radiante media per ciascuna articolazione del ginocchio. Se l'efficienza radiante viene calcolata anche sulle gambe controlaterali, normalizzare i dati dividendo la misurazione dell'efficienza radiante per la gamba ferita per la misurazione dell'efficienza radiante della gamba controlaterale.
NOTA: Se si utilizza una regione di interesse con un'area coerente per tutte le ginocchia, sia l'efficienza radiante totale che l'efficienza radiante media produrranno risultati simili. Si consiglia di utilizzare un'efficienza radiante media se si utilizzano regioni di interesse con dimensioni diverse. La normalizzazione dei dati sull'efficienza radiante dell'articolazione lesionata con i dati del ginocchio controlaterale non lesionato fornirà un controllo interno per tenere conto di eventuali differenze nella quantità di sonda iniettata e nell'efficienza di erogazione tra i diversi animali.
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Representative Results
Dopo aver applicato una singola forza di compressione (1 mm/s fino alla lesione) sulla parte inferiore delle zampe di topi maschi C57BL/6J di 3 mesi, la lesione del LCA è stata costantemente indotta in tutti i topi. La forza di compressione media in caso di lesione al ginocchio è stata di circa 10 N (Figura 1).
L'analisi FRI ha mostrato un'attività della proteasi significativamente maggiore nelle articolazioni danneggiate dei topi sottoposti a lesione non invasiva del LCA a 7 giorni dalla lesione (Figura 2). L'analisi FRI delle articolazioni del ginocchio è stata eseguita anche su topi sottoposti a ristabilizzazione chirurgica dell'articolazione del ginocchio immediatamente dopo la lesione non invasiva del LCA, simile a quanto precedentemente descritto nei ratti 35,36,38. Questa analisi ha mostrato un segnale fluorescente considerevolmente maggiore nei topi sottoposti a chirurgia di ristabilizzazione rispetto ai topi che non hanno subito un intervento chirurgico sia a 2 che a 4 settimane dopo l'infortunio. Questi dati suggeriscono che le procedure chirurgiche invasive possono confondere l'analisi dell'attività della proteasi nell'articolazione.
Figura 1: Configurazione non invasiva della lesione del legamento crociato anteriore e un grafico forza-tempo durante la lesione. (A,B) La parte inferiore della gamba del mouse è posizionata verticalmente nel sistema, con la caviglia posizionata in una tacca del dispositivo superiore e l'articolazione del ginocchio posizionata in una coppa poco profonda sul dispositivo inferiore. Il dispositivo inferiore è bloccato in posizione con una vite di fermo dopo aver applicato manualmente un precarico di 1-2 N. (C) Grafico di spostamento forzato, che mostra la lesione del legamento crociato anteriore a circa 9 N. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging a riflettanza in fluorescenza che rileva l'attività della proteasi nelle articolazioni del ginocchio del topo. (A,B) Immagini rappresentative di topi non feriti (A) e feriti (B) a seguito di lesioni. (C) Efficienza radiante media di entrambe le articolazioni del ginocchio per topi non feriti e feriti una settimana dopo la lesione non invasiva del LCA. Le articolazioni lesionate hanno mostrato un'efficienza radiante media maggiore del 43% rispetto alle articolazioni controlaterali e alle articolazioni di topi non feriti. (D) Efficienza radiante totale normalizzata (R/L) per topi non invasivi feriti e topi feriti che sono stati anche sottoposti a chirurgia di ristabilizzazione articolare. È stata osservata un'efficienza radiante maggiore del ~30%-80% nelle articolazioni lesionate rispetto alle articolazioni controlaterali a 1-4 settimane dopo la lesione. Al contrario, le articolazioni operate chirurgicamente hanno mostrato ~ 300% in più di efficienza radiante alla settimana 4 rispetto alle articolazioni controlaterali, suggerendo un notevole effetto confondente della chirurgia. **P < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo ha stabilito e descritto rigorosamente un metodo riproducibile e non invasivo per indurre la lesione del LCA nei topi 20,21,24,33. Questo metodo di lesione semplice ed efficiente può essere eseguito in pochi minuti, il che facilita gli studi ad alto rendimento della PTOA. Questo metodo di lesione ricapitola anche da vicino le condizioni di lesione rilevanti per la lesione del LCA umano. I metodi chirurgici utilizzati per indurre l'OA nei topi possono precludere l'uso di metodi di imaging in vivo per misurare il decorso temporale e l'entità dell'attività della proteasi nell'articolazione a seguito di lesione. Al contrario, i modelli murini OA non invasivi (esaminati in20) combinati con FRI forniscono una capacità unica per l'imaging in vivo dell'attività della proteasi nelle articolazioni del ginocchio del topo dopo una lesione.
La risposta infiammatoria a seguito di una lesione è di fondamentale importanza nella progressione dell'OA. Tuttavia, i metodi utilizzati per analizzare l'infiammazione nell'articolazione sono in genere costosi, dispendiosi in termini di tempo e distruttivi. Ad esempio, tecniche come la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR) o l'RNAseq possono essere utilizzate per quantificare un'ampia gamma di geni in intere articolazioni, singoli tessuti o singole cellule. Tuttavia, questo metodo richiede l'eutanasia dei topi per acquisire articolazioni del ginocchio ferite e non lesionate. Questi topi non possono essere analizzati in più punti temporali, come un punto temporale precoce durante il picco di risposta alla proteasi (cioè 3-14 giorni dopo la lesione) e un punto temporale successivo quando l'OA è più grave (cioè 4-6 settimane dopo la lesione). Al contrario, la FRI combinata con la lesione articolare non invasiva fornisce la capacità di analizzare l'attività della proteasi in più punti temporali nelle articolazioni del ginocchio dei topi in vivo39. Ciò consente l'analisi longitudinale degli stessi topi e rende la FRI un risultato relativamente più economico rispetto alla RT-PCR o all'RNAseq. Inoltre, è possibile acquisire simultaneamente più sonde o target a diverse lunghezze d'onda, il che può fornire risultati multipli per scopi diversi. La misurazione dell'attività della proteasi nell'articolazione mediante FRI non fornisce una quantificazione rigorosa di tutti i processi infiammatori che si verificano durante la progressione dell'OA, ma i dati in vivo e longitudinali forniti da questo metodo possono comunque essere utili per monitorare l'entità e il decorso temporale dell'attività della proteasi infiammatoria a seguito di lesione articolare.
La soluzione di sonda attivabile a fluorescenza utilizzata per l'imaging FRI dell'attività della proteasi deve essere somministrata per via endovenosa (IV). I modi più comuni per eseguire l'iniezione endovenosa nei topi sono l'iniezione della vena caudale e l'iniezione retro-orbitale. L'iniezione retroorbitale è spesso più facile da eseguire e facilita il volume di iniezione necessario più facilmente rispetto all'iniezione della vena caudale. La letteratura indica anche che la somministrazione retro-orbitale può causare meno stress ai topi senza alcuna differenza nella somministrazione o nell'efficacia del farmaco rispetto all'iniezione della vena caudale40. Questi risultati suggeriscono che l'iniezione retroorbitale è adatta per iniettare la soluzione sonda attivabile a fluorescenza per l'imaging FRI.
La risoluzione di FRI è relativamente bassa rispetto ad altre tecniche di imaging, ma i risultati quantitativi possono fornire informazioni sufficienti sul decorso temporale e sull'entità della risposta alla proteasi infiammatoria durante la progressione dell'OA. Un limite di questa tecnica è che l'autofluorescenza tissutale potrebbe influenzare i risultati, ma questo problema può essere risolto con un piano accurato prima dell'esperimento (tipo di sonda, ceppo di topi, posizionamento dell'animale, ecc.). A differenza di altri metodi di imaging preclinico (ad esempio, microPET, microSPECT, microCT, MRI), FRI non è in grado di essere tradotto direttamente in una modalità di imaging clinico a causa delle drastiche differenze di dimensioni tra topi e esseri umani poiché la profondità di penetrazione della luce è limitata. Tuttavia, negli studi preclinici che utilizzano modelli di roditori, l'articolazione del ginocchio è vicina alla pelle con una copertura minima dei tessuti molli. Di conseguenza, FRI è uno strumento efficace per rilevare l'attività della proteasi nell'articolazione del ginocchio dei topi.
In conclusione, la lesione non invasiva del LCA fornisce un metodo semplice e riproducibile per avviare la PTOA nei topi. Questo metodo di lesione facilita anche l'uso di sonde attivabili dalla proteasi e di imaging a riflettanza di fluorescenza per la misurazione in vivo del decorso temporale e dell'entità dell'attività della proteasi infiammatoria nelle articolazioni del topo durante la progressione dell'OA. Studi futuri potrebbero utilizzare queste tecniche e le molteplici sonde attivabili a fluorescenza nel vicino infrarosso disponibili in commercio per studiare i meccanismi di progressione dell'OA in topi di diverse età, sesso e background genetici o per valutare potenziali terapie per rallentare o prevenire la progressione dell'OA dopo una lesione articolare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, parte del National Institutes of Health, con il numero di premio R01 AR075013.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline | Tissue Protech | PBS01-32R | or equivalent |
| Air Anesthetia System | Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone | ||
| Buprenorphine | Analgesic post-injury | ||
| Depilatory Cream | Veet | B001KYPZ4G | or equivalent |
| Fixtures | Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform | ||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Can also use comparable optical imaging system |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 06-666 | or equivalent |
| Living Image software | Perkin Elmer | ||
| Materials testing systems | TA Instruments | Electroforce 3200 or equivalent | |
| ProSense680 | Perkin Elmer | NEV10003 | Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc. |
| Sterile Syringe with Needle | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 550-82231-CS | Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent |
| Uniaxial load cell | TA Instruments | 20 N capacity | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | SI-0236 | or equivalent |
| WinTest software | TA Instruments | compatible with Electroforce 3200 |
References
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