Dissection de la strie vasculaire de souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage

Summary

La strie vasculaire est vitale pour la génération du potentiel endocochléaire. Ici, nous présentons la dissection de la strie vasculaire de la souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage.

Abstract

Le potentiel endocochléaire, qui est généré par la strie vasculaire, est essentiel pour maintenir un environnement propice à une mécanotransduction appropriée des cellules ciliées et, finalement, à l’audition. Les pathologies de la strie vasculaire peuvent entraîner une diminution de l’audition. La dissection de la strie vasculaire adulte permet la capture focalisée d’un seul noyau, puis le séquençage et l’immunomarquage d’un seul noyau. Ces techniques sont utilisées pour étudier la physiopathologie de la strie vasculaire au niveau unicellulaire.

Le séquençage mononucléal peut être utilisé dans le cadre de l’analyse transcriptionnelle de la strie vasculaire. Pendant ce temps, l’immunomarquage continue d’être utile pour identifier des populations spécifiques de cellules. Les deux méthodes nécessitent une dissection appropriée de la strie vasculaire comme condition préalable, ce qui peut s’avérer techniquement difficile.

Introduction

La cochlée se compose de trois chambres remplies de liquide, la scala vestibuli, la scala media et la scala tympan. La scala vestibuli et la scala tympani contiennent chacune de la périlymphe, qui a une forte concentration de sodium (138 mM) et une faible concentration de potassium (6,8 mM)¹. La scala media contient de l’endolymphe, qui a une forte concentration de potassium (154 mM) et une faible concentration de sodium (0,91 mM)^1,2,3. Cette différence de concentration ionique peut être appelée potentiel endocochléaire (EP) et est principalement générée par le mouvement des ions potassium à travers divers canaux ioniques et jonctions lacunaires dans la strie vasculaire (SV) le long de la paroi latérale de la cochlée 4,5,6,7,8,9,10,11 . Le SV est un tissu hétérogène hautement vascularisé qui tapisse la face médiale de la paroi latérale de la cochlée et contient trois principaux types de cellules : les cellules marginales, intermédiaires et basales¹² (Figure 1).

Les cellules marginales sont reliées par des jonctions serrées pour former la surface la plus médiale du SV. La membrane apicale fait face à l’endolymphe de la scala moyenne et contribue au transport des ions potassium dans l’endolymphe en utilisant divers canaux, y compris KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 et Na+-K⁺-ATPase (NKA)^5,10,13,14. Les cellules intermédiaires sont des cellules pigmentées qui résident entre les cellules marginales et basales et facilitent le transport du potassium à travers le SV en utilisant KCNJ10 (Kir 4.1)^15,16. Les cellules basales se trouvent à proximité de la paroi latérale de la cochlée et sont étroitement associées aux fibrocytes du ligament spiralé pour favoriser le recyclage du potassium de la périlymphe¹². La pathologie du SV a été impliquée dans de nombreux troubles otologiques^17,18. Les mutations dans les gènes exprimés dans les principaux types de cellules SV, tels que Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 et Cldn11, peuvent causer la surdité et le dysfonctionnement de SV, y compris la perte de EP 19,20,21,22,23. En plus des trois principaux types cellulaires, il existe d’autres types de cellules moins étudiés dans le SV, tels que les cellules fusiformes 22, les cellules racinaires^12,24, les macrophages 25, les péricytes 26 et les cellules endothéliales 27^, qui ont des rôles incomplètement définis impliquant l’homéostasie ionique et la génération de EP ²⁸.

Par rapport au séquençage de l’ARN en vrac, le séquençage de l’ARN à noyau unique (sNuc-Seq) fournit des informations sur l’hétérogénéité cellulaire, plutôt qu’une moyenne de l’ARNm dans un groupe de cellules²⁹, et peut être particulièrement utile lors de l’étude de l’hétérogène SV³⁰. Par exemple, sNuc-Seq a produit une analyse transcriptionnelle qui suggère qu’il pourrait y avoir un rôle pour les cellules fusiformes et racinaires dans la génération de PE, la perte auditive et la maladie de Ménière¹⁸. Une caractérisation transcriptionnelle plus poussée des différents types de cellules SV peut nous fournir des informations précieuses sur la physiopathologie sous-jacente aux différents mécanismes et sous-types de fluctuation auditive et de perte auditive liée à la SV. La récolte de ces structures délicates de l’oreille interne est d’une importance primordiale pour une analyse tissulaire optimale.

Dans cette étude, l’approche de microdissection pour accéder à la strie vasculaire et l’isoler de la cochlée de souris adulte pour sNuc-Seq ou immunomarquage est décrite. La dissection de la SV de souris adulte est nécessaire pour comprendre divers types de cellules SV et caractériser davantage leur rôle dans l’audition.

Protocol

Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health. Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies ne…

Representative Results

Nous présentons une méthode pour isoler le SV à utiliser pour le sNuc-Seq ou l’immunomarquage. L’anatomie pertinente (Figure 1) de la cochlée par rapport à la SV peut aider les utilisateurs à mieux comprendre l’organisation de la SV et les étapes du protocole de dissection. Chaque étape de cette microdissection de SV à partir d’une souris P30 est détaillée dans la vidéo associée, et des instantanés des étapes clés de cette dissection et de …

Discussion

Avant l’avènement du séquençage unicellulaire, de nombreux chercheurs utilisaient l’analyse tissulaire en vrac, qui ne permettait que d’analyser les transcriptomes moyennés entre les cellules. En particulier, single-cell et sNuc-Seq ont permis d’isoler le transcriptome d’une seule cellule ou d’un seul noyau, respectivement³². Dans ce cas, les transcriptomes mononucléaux peuvent être identifiés pour les cellules marginales, intermédiaires et basales, ainsi que pour les cellules …

Materials

10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections