Stria vascularis er afgørende for dannelsen af endochoclear potentiale. Her præsenterer vi dissektionen af den voksne mus stria vascularis til enkeltkernesekventering eller immunfarvning.
Endochollear potentiale, som genereres af stria vascularis, er afgørende for at opretholde et miljø, der fremmer passende hårcellemekanotransduktion og i sidste ende hørelse. Patologier i stria vascularis kan resultere i nedsat hørelse. Dissektion af den voksne stria vascularis muliggør fokuseret enkeltkerneindfangning og efterfølgende enkeltkernesekventering og immunfarvning. Disse teknikker bruges til at studere stria vascularis patofysiologi på enkeltcelleniveau.
Enkeltkernesekventering kan anvendes til indstilling af transkriptionel analyse af stria vascularis. I mellemtiden er immunfarvning fortsat nyttig til identifikation af specifikke populationer af celler. Begge metoder kræver korrekt stria vaskularis dissektion som en forudsætning, hvilket kan vise sig at være teknisk udfordrende.
Cochlea består af tre væskefyldte kamre, scala vestibuli, scala media og scala tympani. Scala vestibuli og scala tympani indeholder hver perilymph, som har en høj koncentration af natrium (138 mM) og en lav koncentration af kalium (6,8 mM)1. Scala-mediet indeholder endolymph, som har en høj koncentration af kalium (154 mM) og en lav koncentration af natrium (0,91 mM)1,2,3. Denne forskel i ionkoncentration kan betegnes som det endokkleære potentiale (EP) og genereres primært ved bevægelse af kaliumioner gennem forskellige ionkanaler og mellemrumskryds i stria vascularis (SV) langs sidevæggen af cochlea 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV er et heterogent, stærkt vaskulariseret væv, der linjer det mediale aspekt af cochleas laterale væg og indeholder tre hovedcelletyper: marginale, mellemliggende og basale celler12 (figur 1).
Marginale celler er forbundet med tætte kryds for at danne SV’s mest mediale overflade. Den apikale membran vender mod scalamediets endolymfe og bidrager til kaliumiontransport ind i endolymfen ved hjælp af forskellige kanaler, herunder KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 og Na + –K + -ATPase (NKA) 5,10,13,14. Mellemceller er pigmenterede celler, der befinder sig mellem marginale og basale celler og letter kaliumtransport gennem SV ved hjælp af KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Basalceller ligger tæt på cochleas laterale væg og er tæt forbundet med fibrocytter i spiralbåndet for at fremme kaliumgenanvendelse fra perilymph12. SV’s patologi har været impliceret i talrige otologiske lidelser17,18. Mutationer i gener udtrykt i de vigtigste SV-celletyper, såsom Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 og Cldn11, kan forårsage døvhed og SV-dysfunktion, herunder tab af EP 19,20,21,22,23. Ud over de tre hovedcelletyper er der andre mindre undersøgte celletyper i SV, såsom spindelceller 22, rodceller12,24, makrofager 25, pericytter 26 og endotelceller 27, der har ufuldstændigt definerede roller, der involverer ionisk homeostase og generering af EP 28.
I sammenligning med bulk RNA-sekventering giver enkeltkerner RNA-sekventering (sNuc-Seq) information om celleheterogenitet snarere end et gennemsnit af mRNA på tværs af en gruppe celler29 og kan være særlig nyttig, når man studerer den heterogene SV30. For eksempel har sNuc-Seq produceret transkriptionsanalyse, der tyder på, at der kan være en rolle for spindel- og rodceller i EP-generation, høretab og Menières sygdom18. Yderligere transkriptionel karakterisering af de forskellige SV-celletyper kan give os uvurderlig information om patofysiologien bag forskellige mekanismer og undertyper af SV-relaterede høreudsving og høretab. Høsten af disse sarte indre ørestrukturer er af afgørende betydning for optimal vævsanalyse.
I dette studie beskrives mikrodissektionsmetoden til at få adgang til og isolere stria vascularis fra den voksne musecochlea til sNuc-Seq eller immunfarvning. Dissektion af den voksne mus SV er nødvendig for at forstå forskellige SV-celletyper og yderligere karakterisere deres rolle i hørelsen.
Før fremkomsten af enkeltcellesekventering brugte mange forskere bulkvævsanalyse, hvilket kun gjorde det muligt at analysere transkriptomer i gennemsnit på tværs af celler. Især gjorde enkeltcelle og sNuc-Seq det muligt at isolere transkriptomet af henholdsvis en enkelt celle eller en enkelt kerne32. I dette tilfælde kan enkeltkernetranskriptomer identificeres for marginale, mellemliggende og basale celler samt spindelceller30. Dette muliggør undersøgelse af transkr…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev delvist støttet af NIH’s intramurale forskningsprogram, NIDCD til M.H. (DC000088)
10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |