Dissektion af stria vascurose hos voksne mus til enkeltkernesekventering eller immunfarvning

Summary

Stria vascularis er afgørende for dannelsen af endochoclear potentiale. Her præsenterer vi dissektionen af den voksne mus stria vascularis til enkeltkernesekventering eller immunfarvning.

Abstract

Endochollear potentiale, som genereres af stria vascularis, er afgørende for at opretholde et miljø, der fremmer passende hårcellemekanotransduktion og i sidste ende hørelse. Patologier i stria vascularis kan resultere i nedsat hørelse. Dissektion af den voksne stria vascularis muliggør fokuseret enkeltkerneindfangning og efterfølgende enkeltkernesekventering og immunfarvning. Disse teknikker bruges til at studere stria vascularis patofysiologi på enkeltcelleniveau.

Enkeltkernesekventering kan anvendes til indstilling af transkriptionel analyse af stria vascularis. I mellemtiden er immunfarvning fortsat nyttig til identifikation af specifikke populationer af celler. Begge metoder kræver korrekt stria vaskularis dissektion som en forudsætning, hvilket kan vise sig at være teknisk udfordrende.

Introduction

Cochlea består af tre væskefyldte kamre, scala vestibuli, scala media og scala tympani. Scala vestibuli og scala tympani indeholder hver perilymph, som har en høj koncentration af natrium (138 mM) og en lav koncentration af kalium (6,8 mM)¹. Scala-mediet indeholder endolymph, som har en høj koncentration af kalium (154 mM) og en lav koncentration af natrium (0,91 mM)^1,2,3. Denne forskel i ionkoncentration kan betegnes som det endokkleære potentiale (EP) og genereres primært ved bevægelse af kaliumioner gennem forskellige ionkanaler og mellemrumskryds i stria vascularis (SV) langs sidevæggen af cochlea 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV er et heterogent, stærkt vaskulariseret væv, der linjer det mediale aspekt af cochleas laterale væg og indeholder tre hovedcelletyper: marginale, mellemliggende og basale celler¹² (figur 1).

Marginale celler er forbundet med tætte kryds for at danne SV’s mest mediale overflade. Den apikale membran vender mod scalamediets endolymfe og bidrager til kaliumiontransport ind i endolymfen ved hjælp af forskellige kanaler, herunder KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 og Na + –K ⁺ -ATPase (NKA) ^5,10,13,14. Mellemceller er pigmenterede celler, der befinder sig mellem marginale og basale celler og letter kaliumtransport gennem SV ved hjælp af KCNJ10 (Kir 4.1)^15,16. Basalceller ligger tæt på cochleas laterale væg og er tæt forbundet med fibrocytter i spiralbåndet for at fremme kaliumgenanvendelse fra perilymph¹². SV’s patologi har været impliceret i talrige otologiske lidelser^17,18. Mutationer i gener udtrykt i de vigtigste SV-celletyper, såsom Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 og Cldn11, kan forårsage døvhed og SV-dysfunktion, herunder tab af EP 19,20,21,22,23. Ud over de tre hovedcelletyper er der andre mindre undersøgte celletyper i SV, såsom spindelceller 22, rodceller^12,24, makrofager 25, pericytter 26 og endotelceller 27, der har ufuldstændigt definerede roller^, der involverer ionisk homeostase og generering af EP ²⁸.

I sammenligning med bulk RNA-sekventering giver enkeltkerner RNA-sekventering (sNuc-Seq) information om celleheterogenitet snarere end et gennemsnit af mRNA på tværs af en gruppe celler²⁹ og kan være særlig nyttig, når man studerer den heterogene SV³⁰. For eksempel har sNuc-Seq produceret transkriptionsanalyse, der tyder på, at der kan være en rolle for spindel- og rodceller i EP-generation, høretab og Menières sygdom¹⁸. Yderligere transkriptionel karakterisering af de forskellige SV-celletyper kan give os uvurderlig information om patofysiologien bag forskellige mekanismer og undertyper af SV-relaterede høreudsving og høretab. Høsten af disse sarte indre ørestrukturer er af afgørende betydning for optimal vævsanalyse.

I dette studie beskrives mikrodissektionsmetoden til at få adgang til og isolere stria vascularis fra den voksne musecochlea til sNuc-Seq eller immunfarvning. Dissektion af den voksne mus SV er nødvendig for at forstå forskellige SV-celletyper og yderligere karakterisere deres rolle i hørelsen.

Protocol

Alle dyreforsøg og procedurer blev udført i henhold til protokoller godkendt af Animal Care and Use Committee of National Institute of Neurological Diseases and Stroke og National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af Animal Care and Use Committee of National Institute of Neurological Diseases and Stroke og National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alle metoder blev …

Representative Results

Vi præsenterer en metode til at isolere SV, der skal bruges til enten sNuc-Seq eller immunfarvning. Den relevante anatomi (figur 1) af cochlea i forhold til SV kan hjælpe brugerne med bedre at forstå organisationen af SV og trin i dissektionsprotokollen. Hvert trin i denne mikrodissektion af SV fra en P30-mus er detaljeret i den tilhørende video, og snapshots af de vigtigste trin i denne dissektion og isolering af SV er vist i figur 2</str…

Discussion

Før fremkomsten af enkeltcellesekventering brugte mange forskere bulkvævsanalyse, hvilket kun gjorde det muligt at analysere transkriptomer i gennemsnit på tværs af celler. Især gjorde enkeltcelle og sNuc-Seq det muligt at isolere transkriptomet af henholdsvis en enkelt celle eller en enkelt kerne³². I dette tilfælde kan enkeltkernetranskriptomer identificeres for marginale, mellemliggende og basale celler samt spindelceller³⁰. Dette muliggør undersøgelse af transkr…

Materials

10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections