단일 핵 시퀀싱 또는 면역염색을 위한 성인 마우스 줄무늬 혈관의 해부
Summary
선조체 혈관은 달팽이관 내 전위 생성에 필수적입니다. 여기에서 우리는 단일 핵 시퀀싱 또는 면역 염색을 위한 성인 마우스 stria vascularis의 해부를 제시합니다.
Abstract
선조체 혈관에 의해 생성되는 내와우 전위는 적절한 유모 세포 기계 형질도입과 궁극적으로 청력에 도움이 되는 환경을 유지하는 데 필수적입니다. 선조체 혈관의 병리는 청력 저하를 초래할 수 있습니다. 성인 선조체 혈관의 해부는 집중된 단일 핵 포획 및 후속 단일 핵 시퀀싱 및 면역 염색을 허용합니다. 이러한 기술은 단일 세포 수준에서 선조체 혈관 병태생리학을 연구하는 데 사용됩니다.
단일 핵 시퀀싱은 선조체 혈관의 전사 분석 설정에 사용할 수 있습니다. 한편, 면역염색은 특정 세포 집단을 식별하는 데 계속 유용합니다. 두 방법 모두 전제 조건으로 적절한 선조체 혈관 박리가 필요하며, 이는 기술적으로 어려울 수 있습니다.
Introduction
달팽이관은 3개의 유체로 채워진 챔버, 스칼라 현관, 스칼라 중막 및 스칼라 고막으로 구성됩니다. 스칼라 현정과 스칼라 고막은 각각 고농도의 나트륨(138mM)과 낮은 농도의 칼륨(6.8mM)을 함유하고 있는 외림프를 함유하고 있습니다.1. 스칼라 배지는 고농도의 칼륨 (154 mM)과 낮은 농도의 나트륨 (0.91 mM)을 갖는 내 림프를 함유하고 있습니다 1,2,3. 이러한 이온 농도의 차이는 달팽이관 내 전위(EP)라고 할 수 있으며, 주로 달팽이관 4,5,6,7,8,9,10,11의 측벽을 따라 선조체 혈관(SV)의 다양한 이온 채널과 간극 접합부를 통한 칼륨 이온의 이동에 의해 생성됩니다 . SV는 달팽이관 외벽의 내측을 둘러싸고 있으며 변연, 중간 및 기저 세포의 세 가지 주요 세포 유형을 포함하는 이질적이고 혈관이 많이 형성된 조직입니다12(그림 1).
변연 세포는 단단한 접합부로 연결되어 SV의 가장 중간 표면을 형성합니다. 정단막은 스칼라 매막의 내림프를 향하고 KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 및 Na+-K+-ATPase(NKA)5,10,13,14를 포함한 다양한 채널을 사용하여 내림프로의 칼륨 이온 수송에 기여합니다. 중간 세포는 변연부와 기저 세포 사이에 존재하며 KCNJ10 (Kir 4.1) 15,16을 사용하여 SV를 통한 칼륨 수송을 촉진하는 색소 세포입니다. 기저 세포는 달팽이관의 외벽에 매우 근접해 있으며 나선형 인대의 섬유세포와 밀접하게 연관되어 외림프에서 칼륨 재활용을 촉진한다12. SV의 병리학은 수많은 이과적 장애에 연루되어 있다17,18. Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 및 Cldn11과 같은 주요 SV 세포 유형에서 발현되는 유전자의 돌연변이는 EP 19,20,21,22,23의 손실을 포함하여 난청 및 SV 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 세 가지 주요 세포 유형 외에도 방추 세포 22, 뿌리 세포12,24, 대식세포 25, 혈관주위세포 26 및 내피 세포 27과 같이 SV에서 덜 연구된 다른 세포 유형이 있으며, 이는 이온 항상성 및 EP 28의 생성과 관련된 역할이 불완전하게 정의되어 있습니다.
벌크 RNA-염기서열분석과 비교하여, 단일-핵 RNA-염기서열분석(sNuc-Seq)은 세포 그룹29에 걸친 mRNA의 평균이 아닌 세포 이질성에 대한 정보를 제공하며, 이질적인 SV30을 연구할 때 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, sNuc-Seq는 EP 생성, 청력 상실 및 메니에르병에서 방추 세포와 뿌리 세포에 역할이 있을 수 있음을 시사하는 전사 분석을 생성했다18. 다양한 SV 세포 유형의 추가 전사 특성화는 SV 관련 청력 변동 및 청력 손실의 다양한 메커니즘 및 하위 유형의 기초가 되는 병태생리학에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 섬세한 내이 구조의 수확은 최적의 조직 분석에 가장 중요합니다.
이 연구에서는 sNuc-Seq 또는 면역염색을 위해 성인 마우스 달팽이관에서 선조체 혈관에 접근하고 분리하기 위한 미세 해부 접근법이 설명됩니다. 성인 마우스 SV의 해부는 다양한 SV 세포 유형을 이해하고 청력에서의 역할을 추가로 특성화하는 데 필요합니다.
Protocol
모든 동물 실험 및 절차는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회와 국립 보건원의 국립 청각 장애 및 기타 의사소통 장애 연구소에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 모든 실험 프로토콜은 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회와 국립 보건원의 국립 난청 및 기타 의사소통 장애 연구소의 승인을 받았습니다. 모든 방법은 국립 신경 질환 ?…
Representative Results
본 발명자들은 sNuc-Seq 또는 면역염색에 사용될 SV를 분리하는 방법을 제시한다. SV와 관련된 달팽이관의 관련 해부학적 구조(그림 1)는 사용자가 SV의 조직과 해부 프로토콜의 단계를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. P30 마우스에서 SV의 미세 해부의 각 단계는 관련 비디오에 자세히 설명되어 있으며, 이 SV 해부 및 분리의 주요 단계에 대한 스냅샷…
Discussion
단일 세포 시퀀싱이 등장하기 전에 많은 연구자들은 벌크 조직 분석을 사용하여 세포 전체에 걸쳐 평균화된 전사체만 분석할 수 있었습니다. 특히, single-cell 및 sNuc-Seq는 각각 단일 세포 또는 단일 핵의 전사체를 분리하는 것을 가능하게 하였다32. 이 경우, 단일핵 전사체는 방추 세포(30) 뿐만 아니라 변연, 중간 및 기저 세포에 대해 확인될 수 있다. 이를 통해 SV ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램, NIDCD에서 MH까지 부분적으로 지원되었습니다 (DC000088)
Materials
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
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Citazione di questo articolo
Strepay, D., Olszewski, R., Taukulis, I., Johns, J. D., Gu, S., Hoa, M. Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining. J. Vis. Exp. (194), e65254, doi:10.3791/65254 (2023).