Сосудистая полость жизненно важна для генерации эндокохлеарного потенциала. Здесь мы представляем вскрытие сосудистой полосы взрослой мыши для секвенирования одного ядра или иммуноокрашивания.
Эндокохлеарный потенциал, который генерируется stria vascularis, необходим для поддержания среды, способствующей соответствующей механотрансдукции волосковых клеток и, в конечном итоге, слуху. Патологии сосудистой полосы могут привести к снижению слуха. Диссекция взрослой полости vascularis позволяет сфокусировать одноядерный захват и последующее одноядерное секвенирование и иммуноокрашивание. Эти методы используются для изучения патофизиологии васкулярной полоски на одноклеточном уровне.
Одноядерное секвенирование может быть использовано в условиях транскрипционного анализа stria vascularis. Между тем, иммуноокрашивание по-прежнему полезно для идентификации конкретных популяций клеток. Оба метода требуют надлежащего рассечения полоски сосудов в качестве предварительного условия, что может оказаться технически сложным.
Улитка состоит из трех заполненных жидкостью камер: преддверия чешуйчатой полосы, средней полости и тимпанской щели. Scala vestibuli и scala tympani содержат перилимфу, которая имеет высокую концентрацию натрия (138 мМ) и низкую концентрацию калия (6,8 мМ)1. Средняя чешуя содержит эндолимфу, которая имеет высокую концентрацию калия (154 мМ) и низкую концентрацию натрия (0,91 мМ)1,2,3. Эта разница в концентрации ионов может быть названа эндокохлеарным потенциалом (EP) и в основном генерируется движением ионов калия через различные ионные каналы и щелевые соединения в stria vascularis (SV) вдоль боковой стенки улитки 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV представляет собой гетерогенную ткань с высокой степенью васкуляризации, которая выстилает медиальный аспект латеральной стенки улитки и содержит три основных типа клеток: маргинальные, промежуточные и базальные клетки12 (рис. 1).
Краевые клетки соединены плотными соединениями, образуя самую медиальную поверхность SV. Апикальная мембрана обращена к эндолимфе средней челюсти и способствует транспорту ионов калия в эндолимфу с использованием различных каналов, включая KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 и Na+-K+-АТФазу (NKA) 5,10,13,14. Промежуточные клетки представляют собой пигментированные клетки, которые находятся между маргинальными и базальными клетками и облегчают транспорт калия через SV с использованием KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Базальные клетки лежат в непосредственной близости от боковой стенки улитки и тесно связаны с фиброцитами спиральной связки, способствуя рециркуляции калия из перилимфы12. Патология СВ связана с многочисленными отологическими заболеваниями17,18. Мутации в генах, экспрессируемых в основных типах клеток SV, таких как Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 и Cldn11, могут вызывать глухоту и дисфункцию SV, включая потерю EP 19,20,21,22,23. В дополнение к трем основным типам клеток в SV есть и другие, менее изученные типы клеток, такие как веретенообразные клетки 22, корневые клетки12,24, макрофаги 25, перициты 26 и эндотелиальные клетки 27, которые имеют не полностью определенные роли, связанные с ионным гомеостазом и генерацией EP 28.
По сравнению с объемным секвенированием РНК, секвенирование РНК с одним ядром (sNuc-Seq) предоставляет информацию о гетерогенности клеток, а не о среднем значении мРНК по группеклеток 29, и может быть особенно полезно при изучении гетерогенного SV30. Например, sNuc-Seq произвел транскрипционный анализ, который предполагает, что веретенообразные и корневые клетки могут играть роль в генерации EP, потере слуха и болезни Меньера18. Дальнейшая транскрипционная характеристика различных типов клеток SV может дать нам бесценную информацию о патофизиологии, лежащей в основе различных механизмов и подтипов флуктуаций слуха и потери слуха, связанных с SV. Сбор этих тонких структур внутреннего уха имеет первостепенное значение для оптимального анализа тканей.
В этом исследовании описан подход микродиссекции для доступа и выделения stria vascularis из улитки взрослой мыши для sNuc-Seq или иммуноокрашивания. Вскрытие SV взрослой мыши необходимо для понимания различных типов SV-клеток и дальнейшей характеристики их роли в слухе.
До появления секвенирования отдельных клеток многие исследователи использовали объемный анализ тканей, который позволял анализировать только транскриптомы, усредненные по клеткам. В частности, single-cell и sNuc-Seq позволили выделить транскриптом одной клетки или одиночного ядра соответст?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было частично поддержано Программой внутренних исследований NIH, NIDCD to M.H. (DC000088)
10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |