A estria vascular é vital para a geração do potencial endococlear. Apresentamos aqui a dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação.
O potencial endococlear, gerado pela estria vascular, é essencial para manter um ambiente propício à adequada mecanotransdução das células ciliadas e, finalmente, à audição. Patologias da estria vascular podem resultar em diminuição da audição. A dissecção da estria vascular do adulto permite a captura focalizada de núcleo único e subsequente sequenciamento e imunomarcação de núcleo único. Essas técnicas são usadas para estudar a fisiopatologia da estria vascular em nível unicelular.
O sequenciamento de núcleo único pode ser usado na análise transcricional da estria vascular. Enquanto isso, a imunomarcação continua a ser útil na identificação de populações específicas de células. Ambos os métodos requerem dissecção adequada da estria vascular como pré-requisito, o que pode revelar-se tecnicamente desafiador.
A cóclea consiste de três câmaras cheias de líquido, a escala vestibular, a escala média e a escala timpânica. A escala vestibular e a escala timpânica contêm perilinfa, que apresenta alta concentração de sódio (138 mM) e baixa concentração de potássio (6,8 mM)1. A escala média contém endolinfa, que apresenta alta concentração de potássio (154 mM) e baixa concentração de sódio (0,91 mM)1,2,3. Essa diferença na concentração de íons pode ser chamada de potencial endococlear (PE), e é gerada primariamente pelo movimento de íons potássio através de vários canais iônicos e junções comunicantes na estria vascular (VS) ao longo da parede lateral da cóclea4,5,6,7,8,9,10,11 . A VS é um tecido heterogêneo, altamente vascularizado, que reveste a face medial da parede lateral da cóclea e contém três tipos celulares principais: células marginais, intermediárias ebasais12 (Figura 1).
As células marginais são conectadas por tight junctions para formar a superfície mais medial da VS. A membrana apical está voltada para a endolinfa da escala média e contribui para o transporte iônico de potássio para a endolinfa usando vários canais, incluindo KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 e Na+–K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. As células intermediárias são células pigmentadas que residem entre as células marginais e basais e facilitam o transporte de potássio através da VS utilizando KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. As células basais estão próximas à parede lateral da cóclea e estão intimamente associadas aos fibrócitos do ligamento espiral para promover a reciclagem de potássio da perilinfa12. A patologia da VS tem sido implicada em inúmeras afecçõesotológicas17,18. Mutações em genes expressos nos principais tipos celulares de VS, como Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 e Cldn11, podem causar surdez e disfunção de VS, incluindo a perda de PE19,20,21,22,23. Além dos três principais tipos celulares, existem outros tipos celulares menos estudados na VS, como as células fusiformes22, as células radiculares12,24, os macrófagos25, os pericitos26 e as células endoteliais27, que têm papéis incompletamente definidos envolvendo a homeostase iônica e a geração de EP28.
Em comparação com o sequenciamento de RNA em massa, o sequenciamento de RNA de núcleo único (sNuc-Seq) fornece informações sobre a heterogeneidade celular, em vez de uma média de RNAm em um grupo de células29, e pode ser particularmente útil ao estudar o SV30 heterogêneo. Por exemplo, o sNuc-Seq produziu uma análise transcricional que sugere que pode haver um papel das células fusiformes e radiculares na geração de PE, perda auditiva e doença de Ménière18. Uma caracterização transcricional adicional dos vários tipos de células da VS pode nos fornecer informações valiosas sobre a fisiopatologia subjacente aos diferentes mecanismos e subtipos de flutuação e perda auditiva relacionados à VS. A colheita dessas delicadas estruturas da orelha interna é de suma importância para a análise ótima dos tecidos.
Neste estudo, a abordagem de microdissecção para acessar e isolar a estria vascular da cóclea de camundongos adultos para sNuc-Seq ou imunomarcação é descrita. A dissecção do VS de camundongos adultos é necessária para entender vários tipos de células VS e caracterizar melhor seu papel na audição.
Antes do advento do sequenciamento de célula única, muitos pesquisadores usaram a análise de tecido em massa, que só tornou possível analisar transcriptomas médios entre células. Em particular, unicelular e sNuc-Seq permitiram isolar o transcriptoma de uma única célula ou núcleo único, respectivamente32. Nesse caso, transcriptomas de núcleo único podem ser identificados para células marginais, intermediárias e basais, bem como células fusiformes30. Isso perm…
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, NIDCD para M.H. (DC000088)
10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |