Summary
このプロトコルは、マウス脂肪組織から間質血管画分(SVF)を半自動分離して、脂肪前駆細胞を取得し、 in vitroで脂肪細胞分化を達成することを説明しています。コラゲナーゼ消化に組織解離剤を使用すると、実験の変動が減少し、再現性が向上します。
Abstract
白色、褐色、ベージュ色の脂肪細胞分化の in vitro 研究により、脂肪細胞の細胞自律機能とそのメカニズムの研究が可能になります。不死化白色前駆脂肪細胞株は公に入手可能であり、広く使用されている。しかし、外部の合図に応答して白色脂肪組織にベージュ色の脂肪細胞が出現することは、公開されている白色脂肪細胞株を使用して完全に再現することは困難です。マウス脂肪組織からの間質血管画分(SVF)の単離は、初代前駆脂肪細胞を取得し、脂肪細胞分化を行うために一般的に実行されます。ただし、脂肪組織のミンチおよびコラゲナーゼ消化は、実験上のばらつきをもたらす可能性があり、汚染されやすくなります。ここでは、実験のばらつきを減らし、汚染を減らし、再現性を高めることを目的として、コラゲナーゼ消化に組織解離因子を利用してSVFの分離を容易にする修正された半自動プロトコルを紹介します。得られた前駆脂肪細胞および分化脂肪細胞は、機能的および機構的解析に使用することができる。
Introduction
脂肪組織生物学は、肥満と2型糖尿病の有病率が世界的に増加しているため、ますます注目を集めています1。脂肪細胞は過剰なエネルギーを脂肪滴の形で蓄え、飢餓時に放出されます。さらに、脂肪組織は、内分泌器官として機能し、他の組織と通信することにより、全身エネルギー恒常性を維持する2,3。興味深いことに、過剰な脂肪組織(肥満)と脂肪喪失(脂肪異栄養症)の両方がインスリン抵抗性と糖尿病に関連しています1。脂肪細胞は、白、茶色、ベージュの3つのタイプに分けられます1。白色脂肪細胞は主に脂質として過剰なエネルギーを蓄えますが、褐色脂肪細胞とベージュ脂肪細胞はミトコンドリア脱共役タンパク質-1(Ucp1)を介して熱の形でエネルギーを放散します1,4。特に、ベージュ色の脂肪細胞(「誘導性」褐色脂肪細胞とも呼ばれる)は、冷または交感神経刺激に応答して白色脂肪組織に現れ、「古典的な」褐色脂肪細胞と重複するがそれとは異なる遺伝子発現パターンを示す5。近年、褐色やベージュ色の脂肪細胞は、「エネルギー摂取の抑制」ではなく「エネルギー散逸の促進」を目的とした抗肥満・抗糖尿病治療の標的として期待されています4。支持的に、ヒトにおけるFTO肥満変異体rs1421085のリスク対立遺伝子は、一般的な変異体6,7の中でより高いボディマス指数(BMI)と最も強い関連を示し、さまざまな遺伝子-環境相互作用を示す8,9、ベージュ脂肪細胞の分化と機能を負に制御することが報告されています10.ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)は、脂肪生成のマスター転写調節因子として知られており、脂肪細胞の分化に必要かつ十分である11。PRD1-BF1-RIZ1を含む16相同ドメイン(PRDM16)、初期b細胞因子2(EBF2)、核因子I-A(NFIA)などの転写調節因子は、褐色およびベージュ色の脂肪細胞の分化と機能に不可欠です12,13,14,15,16,17,18.一方、白色脂肪細胞遺伝子プログラミングには、トランスデューシン様エンハンサータンパク質3(TLE3)やジンクフィンガータンパク質423(ZFP423)などの転写調節因子が必要です19,20,21。
in vitroモデルシステムにより、脂肪細胞の機能と機能障害の根底にあるメカニズムの理解を深めることを目的とした分子研究を行うことができます。3T3-L1や3T3-F442Aなどの公的に入手可能で不死化された前駆脂肪細胞株は存在しますが22,23,24、初代前駆脂肪細胞の培養と脂肪細胞への分化は、in vivo脂肪生成を研究するためのより適切なモデルです。マウス脂肪組織からの間質血管画分(SVF)の単離は、初代前駆脂肪細胞を得るための周知の方法である25,26。しかしながら、脂肪組織のコラゲナーゼ消化は、チューブラックを備えたバクテリアシェーカーを用いて一般的に行われるが、実験的変動をもたらす可能性があり、汚染されやすい27,28。ここでは、SVFの単離を容易にするために、コラゲナーゼ消化に穏やかな磁気活性化細胞選別(MACS)組織解離剤を使用する代替プロトコルについて説明します。
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Protocol
このプロトコルに記載されているすべての動物実験は、東京大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、東京大学の機関ガイドラインに従って実施されました。
1.酵素液および培地の調製
- 7〜8週齢のマウスの鼠径部白色脂肪組織(右側と左側、約150 mg)の両側と2.5 mLの酵素溶液を解離器のチューブCに入れます。
- 酵素Dをウシ胎児血清(FBS)または抗生物質を含まない3 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/F12で、酵素RをFBSまたは抗生物質を含まない2.7 mLのDMEM/F12で、酵素Aを1 mLのバッファーAで再構成します。
- チューブCに酵素D100 μL、酵素R50 μL、酵素A12.5 μL、DMEM/F12 2.35 mLを加え、チューブCを酵素溶液で氷上にセットし、酵素溶液を調製します。
2.脂肪組織の分離
- 頸部脱臼により、7〜8週齢の雄C57BL / 6Jマウス(約20 g)を安楽死させます。.
- クリーンベンチで、鼠径部の白い脂肪組織を分離するために、腹部と下肢に向かって鈍い/鋭いハサミで皮膚を切ります。鋭利な/鋭いはさみを使用して太ももの内側から脂肪組織を分離します。鼠径脂肪組織の片側は~75mgです。
- 単離した脂肪組織を氷上で酵素溶液を入れたチューブCに入れ、チューブをクリーンベンチ内に保ち、無菌性を維持します。
3.脂肪組織のミンチと消化
- クリーンベンチで、チューブCに2.5 mLの酵素溶液を加えます。
- 鋭利な/鋭いはさみで50回切って脂肪組織を細かく刻みます。脂肪組織を~2mm2 個に切ります。
- チューブCのキャップをしっかりと閉じ、チューブを逆さまにして、キャップを装着した状態で組織解離器のスリーブに取り付けます。その後、サンプルを37°Cで~40分間消化します。
注:この研究では、ヒーター付きgentleMACSオクト解離器(Miltenyi Biotec 130-096-427)を使用し、プリインストールされたプログラム「37C_mr_ATDK_1」に従いました。
4.細胞懸濁液のろ過
- 10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM/F12を37°Cに予熱します。
- チューブCを組織解離器から外し、10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM/F12を5 mL加え、穏やかにピペッティングして消化を停止します。
- 700 x g で20°Cで10分間遠心分離します。
- 細胞ペレットを乱すことなく上清を注意深く吸引する。
- 10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM/F12を10 mL加え、穏やかに5回ピペッティングしてペレットを再懸濁します。
- 新しい50 mLチューブに置いた直径70 μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過します。
- 250 x g で5分間遠心分離し、ペレットを10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。
5.セルプレーティング
- 500 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM/F12を10 mL加え、ピペッティングを10回行ってペレットを再懸濁します。
- 細胞懸濁液を10cmコラーゲンコーティングディッシュにプレートし、ディッシュを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に1〜2時間入れます。
注:コラーゲンコーティングされた皿は絶対に必要というわけではありません。しかし、経験に基づいて、コラーゲンコーティングされた皿は前駆脂肪細胞の接着を助け、したがって細胞の生存率を高めます。 - 培地を吸引し、洗浄ごとに3 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。
- 10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM/F12を10 mL加え、ディッシュを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に戻します。
6.前駆脂肪細胞の継代
- 翌日、培地を吸引し(細胞が接着するため、培地を吸引できます)、1回の洗浄につき3 mLのPBSで細胞を2回洗浄し、10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM/F12を10 mL加えます。
- 細胞が80%コンフルエントに達したら(通常、SVF分離の4日後に)、細胞を4つの10cmコラーゲンコーティングディッシュに分割します。
- 具体的には、培地を吸引し、細胞をPBS(室温[RT])で洗浄し、予め温めた0.05%トリプシン1 mLを加え、細胞培養インキュベーター内で5分間インキュベートします。
- 10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM/F12を10 mL添加して、トリプシン活性を消光します。ピペッティング後、440 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM/F12を40 mL加えて細胞を再懸濁し、10 cmコラーゲンコーティングされた4つのディッシュに細胞をプレートします。
- 細胞が80%のコンフルエントに達したら、細胞を再び継代する。
7.脂肪前駆細胞の不死化のためのSV40大型T抗原を発現するレトロウイルスの調製(オプション)
- 不死化の少なくとも3日前に、抗生物質を含まない10%FBSを含む2 mLのDMEM中に3.0 x 105細胞/ mLの密度でPlatinum-E(Plat-E)細胞29を包装します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
- 翌日、製造元の指示に従って、リポフェクタミン2000を使用して4 μgのpBABE-neo largeTcDNA(遺伝子プラスミド#1780を追加)をトランスフェクトします。
- 24時間後、培地を吸引し、10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む2 mLのDMEMを追加します。
- 翌日、レトロウイルス上清を回収する。レトロウイルスは、直ちに不死化に使用することも、-80°Cで保存することもできます。
8.SV40ラージT抗原による前駆脂肪細胞の不死化(オプション)
- SVF単離後に前駆脂肪細胞を2回継代および拡張する。
- 10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む2 mLのDMEM/F12中の0.5-1.0 x 104 細胞/mLの密度で6ウェルプレートに細胞をプレートします。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
- 翌日、SV40大型T抗原を発現する新鮮または融解したレトロウイルスを6ウェルプレートのウェルあたり250 μL調製します。440 x g で5分間遠心分離し、上清を新しいチューブに入れます。
- レトロウイルス上清250 μLあたり、10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む750 μLのDMEM/F12と1 μLのポリブレンを加えて、有効なウイルスを作ります。
- 培地を吸引し、脂肪前駆細胞を含む各ウェルに1,000 μLの作動レトロウイルスを加えます。
- 4時間後に10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM/F12を1mL加えます。
- 翌日、感染した前駆脂肪細胞を10 cmの皿に分離し、10%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および500 μg/mLネオマイシンを含むDMEM/F12で感染細胞を選択します。抗生物質の選択を監視するために、ネオマイシンで感染していない細胞の皿を準備します。
- モニターディッシュ内のすべての非感染細胞が死ぬまで、感染細胞をネオマイシンで継代し続けます。
9.脂肪細胞の分化
- 細胞をプレートします。12ウェルプレートの場合、10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む1 mLのDMEM/F12に4.0 x 104 細胞/mLの密度で細胞をプレートします。
- 前駆脂肪細胞がコンフルエントになったら(プレーティング後48〜72時間)、培地を吸引し、分化培地と交換します(組成については 表1 を参照)。
- 分化の2日目(すなわち、分化誘導後48時間)に、培地を維持培地と交換する(組成については 表1 を参照されたい)。その後、2日ごとにメンテナンス培地を交換してください。最終分化は分化の7日目に達成される。
- オイルレッドo染色
- オイルレッド染色の場合は、培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのPBSで細胞を洗い流します。ウェルあたり1 mLの4%ホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、RTで15分間細胞をインキュベートします。
- インキュベーション中に、ddH2Oを使用して0.5%オイルレッドoストック溶液(イソプロピルアルコール中)を0.3%に希釈し、ろ紙を使用して作業溶液を濾過する。
- 15分間のインキュベーション後、ホルムアルデヒドを除去し、60%イソプロピルアルコールで細胞をすすぎ、1mLのろ過オイルレッドo作業溶液を加え、RTで1時間インキュベートします。
- インキュベーション後、細胞を流水で洗います。その後、脂質を含んだ脂肪細胞を倒立顕微鏡(倍率:対物レンズ20倍、接眼レンズ10倍)で観察します。
- mRNA発現解析
注:この研究で使用されたプライマーのリストについては、 表2 を参照してください。- 培地を吸引し、1 mL/ウェルのトリゾールをウェルに加えます。
- RTで15分間インキュベートし、ピペッティングで細胞を剥離し、1.5 mLチューブにサンプルを採取します。サンプルは、RNA抽出まで-80°Cで保存できます。
- 凍結したサンプルをRTに解凍し、サンプルに200 μLのクロロホルムを加え、15秒間激しく振とうします。
- サンプルをRTで3分間インキュベートした後、20,000 x g で4°Cで15分間スピンします。
- 水相(上部、無色)を慎重に取り除き、新しいチューブに移します。タンパク質相(中央、白)またはフェノール/クロロホルム相(下、ピンク)は絶対に移さないでください。
- 等量の70%EtOHをゆっくりと加え、穏やかに混合します。ボルテックスしないでください。
- サンプル(最大700 μL)を、収集チューブに装着したRNAスピンカラムにロードします。形成された可能性のある沈殿物を必ず含めてください。
- 9,000 x g で4°Cで30秒間回転し、フロースルーを破棄します。
- 700 μLのバッファーRW1を加え、9,000 x g で4°Cで30秒間スピンした後、フロースルーを破棄します。
- カラムを新しい収集チューブに移し、500 μLのバッファーRPEを加えます。
- 9,000 x g で4°Cで30秒間回転し、フロースルーを破棄します。
- 500 μLのバッファーRPEを加え、9,000 x g で4°Cで2分間スピンした後、フロースルーを破棄します。
- カラムを新しい収集チューブに移し、9,000 x g で4°Cで1〜2分間スピン(バッファーなしのカラム)します。
- カラムを新しい1.5 mL収集チューブに移し、30 μLのRNaseフリー水をカラムメンブレンに直接加えます。
- サンプルをRTで1〜2分間インキュベートします。その後、9,000 x g で4°Cで1分間スピンし、RNAを溶出させます。
- 蛍光分光計を使用してRNA濃度を確認します。
注:ここで濃度を調整することをお勧めします。 - ~200 ngのRNAテンプレートを使用して逆転写を実行します。市販の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR-RT)キットを使用し、製造元のプロトコルに従ってください。反応後、cDNAを20倍に希釈して200 μLにします。
- 384ウェルプレートの各ウェルに、2.0 μLのcDNA、3.0 μLのパワーシブルグリーンマスターミックス、0.018 μLの100 μM qPCRフォワードプライマー、0.018 μLの100 μM qPCRリバースプライマー、および0.96 μLのddH2Oを追加します。
- qPCRを実行します(ホールドステージ:50°Cで2分間、95°Cで2分間;PCRステージ:95°Cで15秒、60°Cで1分間の40サイクル。メルトカーブステージ:95°Cで15秒、60°Cで1分間、95°Cで15秒)。定量には検量線法を使用します。
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Representative Results
このプロトコルは、脂肪細胞分化誘導の7日後に完全に分化した脂質を含んだ脂肪細胞を生成します。脂肪細胞の分化の程度は、トリグリセリドおよび脂質のオイルレッドo染色(図1A)、または脂肪生成のマスターレギュレーターであるPpargおよびその標的Fabp4などの脂肪細胞遺伝子のqPCR-RTを用いたmRNA発現解析(図1B)によって評価することができる。インビトロでベージュ色の脂肪細胞分化を誘導するために、ロシグリタゾンなどのPPARγアゴニストのチアゾリジンジオンクラスを使用することができる。実際、ロシグリタゾンを用いた実験では、Ucp1やPpargc1aなどの褐色脂肪特異的遺伝子の発現レベルに対する1μMまでの濃度の用量依存的な効果が観察されます。一方、Fabp4に対するロシグリタゾンの効果は0.1μMの濃度で飽和しています(図1C)。
このプロトコルによって得られた分化脂肪細胞は、酸素消費率(OCR)分析16,30(図2A)およびクロマチン免疫沈降31(ChIP;図2B)。不死化前駆脂肪細胞は、生存率を失うことなく液体窒素細胞貯蔵システムに保存でき、実験で使用するためにいつでも解凍できます。
図1:脂肪前駆細胞の脂質含有脂肪細胞への分化。 (A)野生型マウスの鼠径部白色脂肪組織(iWAT)由来のSVFを脂肪細胞分化の0日目または7日目にオイルレッドoで染色した。(B)脂肪細胞分化の0日目および7日目におけるPpargおよびFabp4のmRNA発現レベル(平均±標準誤差の平均[S.E.M.];N = 3)。(c)0.1、0.2、0.5、および1.0 μMロシグリタゾンで処理したSVF由来脂肪細胞における一般的な脂肪細胞マーカーFabp4ならびに褐色脂肪特異的遺伝子Ucp1およびPpargc1aのmRNA発現、ならびに分化および維持培地。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:分化した脂肪細胞を用いた機能的および機構的解析の例。 (A)iWAT SVF由来脂肪細胞のOCR解析(N=10)。(B)分化0日目および7日目におけるNfia flox/flox iWAT SVF由来脂肪細胞におけるH3K27AcのChIP-qPCR。Ins-0.4 kb および Fabp4-13 kb サイトはバックグラウンド サイトとして表示されます (平均± S.E.M.N = 2)。両方の実験で、1.0 μMロシグリタゾンを分化および維持培地とともに添加して、ベージュ色の脂肪細胞分化を誘導しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:分化および維持培地の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:本研究で使用したプライマーのリスト。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、マウス脂肪組織からSVFを単離して脂肪前駆細胞を取得し、 in vitroで脂肪細胞分化を行うためのプロトコルについて説明する。コラゲナーゼ消化に組織解離剤を使用すると、実験のばらつきが減少し、汚染のリスクが減少し、再現性が向上しました。この手順は提示されたプロトコル内の重要なステップですが、プロセスは高度に自動化されており、最適化は必要ありません。ただし、マウスの年齢と脂肪組織デポーによっては、サイズピースや切断時間などのミンチの最適化が必要になる場合があります。
SVFは、前駆脂肪細胞、マクロファージなどの免疫細胞、内皮細胞、その他の細胞からなる不均一な集団として知られています。前駆脂肪細胞は培養皿に接着し、洗浄や培地交換に耐性があるため、継代中に細胞集団に富化されます。しかしながら、このプロトコルによって得られた「前駆脂肪細胞」は依然として不均一であると仮定することは合理的である。より純粋な前駆脂肪細胞集団を得るためには、PDGFRα32などの前駆脂肪細胞の表面マーカーに対する抗体を用いた蛍光活性化セルソーティング(FACS)が必要です。
要約すると、ここでは、コラゲナーゼ消化のための組織解離剤を用いたSVF単離のためのプロトコルを記載した。このプロトコルは、チューブラックを備えたバクテリアシェーカーを使用する従来のプロトコルと比較してSVFの分離が容易であり、実験の変動の減少、汚染の減少、および再現性の向上を提供します16、17、18。
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Disclosures
著者の誰も、この作品に関連して競合する金銭的利益を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、和田貴仁と吉田彩子(東京大学、東京、日本)の実験支援に感謝したい。この研究は、Y.H.への以下の助成金によって資金提供されました:東京大学優秀若手研究者プログラムからの研究助成金。日本学術振興会 科研費若手研究, 課題番号 19K17976;日本応用酵素学財団からの将来の糖尿病研究のフロントランナー(FFDR)への助成金、助成金番号17F005;薬理学研究財団からの助成金。持田記念医学薬学研究財団からの助成金。MSDライフサイエンス財団からの助成金。大和証券健康財団からの助成金。東京生化学研究財団からの助成武田薬品科学財団からのライフサイエンス研究助成金。専心医学研究財団からの助成金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
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